李经增,纪明开,林心瑜,张 良,苏良宝
(1.三明市皮肤病医院,福建 三明 365000;2.福建医科大学第一临床医学院,福建 福州 350000;3.厦门医学院附属第二医院,福建 厦门 361000;4.复旦大学附属中山医院厦门医院,福建 厦门 361000;5.泉州市安溪县医院,福建 泉州 362400)
乳房外Paget病(EMPD)是好发于顶泌汗腺数量较集中、非曝光区域的恶性皮肤腺癌,表现为不对称扩大的发展过程且特殊类型的异位性EMPD可累及口腔黏膜及口腔周围、腋窝、下腹部等处。本研究应用免疫组织化学(免疫组化)检测核因子受体激活因子κB配体(RANKL),磷酸化细胞外信号调节激酶-1/2(p-ERK1/2),磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)在EMPD中的表达,探讨3条信号通路的生物学意义。
1.1一般资料 80例确诊为EMPD患者于2008-2017年在福建医科大学附属第一医院皮肤科及福建省皮肤性病防治院就诊,其中男70例,发病年龄51~86岁,平均(64.48±8.19)岁;女10例,发病年龄51~73岁,平均(59.6±6.87)岁;发病至确诊时间2~60个月,平均(28.8±3.6)个月。
1.2方法 采用免疫组化检测患者标本中RANKL,p-ERK1/2,p-mTOR的表达。
1.2.1试剂 使用北京博奥森生物技术有限公司生产的免疫组化试剂,实验步骤参照试剂盒说明书进行。抗体稀释比率均为1∶200。
1.2.2结果判定 选取5个高倍视野进行阳性细胞平均百分比、染色强度评分。阳性细胞占细胞总数比例小于5%计0分,5%~25%计 1分,>25%~50%计2分,>50%~75%计3分,>75%计4分。染色强度评分:细胞核无染色计0分,散在分布浅棕色或浅红色计1分,弥漫分布棕色或红色计2分,弥漫分布深棕色或深红色计3分。依两项之和判定:0分为阴性(-),1~2分为弱阳性(+),3~4分为阳性(++),5分及以上为强阳性(+++)[1]。
2.1RANKL在EMPD中的表达 RANKL定位于肿瘤细胞的细胞核,阴性(-)14例,弱阳性(+)11例,阳性(++)23例,强阳性(+++)32例,见图1。
2.2p-ERK1/2在EMPD中的表达 p-ERK1/2定位于肿瘤细胞的细胞核,阴性(-)11例,弱阳性(+)15例,阳性(++)18例,强阳性(+++)36例,见图2。
A.镜检倍数:100×;B.镜检倍数:200×。
A.镜检倍数:100×;B.镜检倍数:200×。
2.3p-mTOR在EMPD中的表达 p-mTOR定位于肿瘤细胞的细胞核,阴性(-)9例,弱阳性(+)12例,阳性(++)18例,强阳性(+++)41例,见图3。
A.镜检倍数:100×;B.镜检倍数:200×。
2.4RANKL与p-ERK1/2、p-mTOR的相关性 RANKL与p-ERK1/2、p-mTOR在EMPD中阳性表达呈正相关[相关系数(r)=0.907、0.931、0.998,P<0.05],见表1。
表1 RANKL与p-ERK1/2、p-mTOR的相关性
RANKL主要由细胞内结构域、跨膜结构域和细胞外肿瘤坏死因子(TNF)家族同源区共同组成。当RANKL识别到激活信号时,其可诱导受体发生构象改变形成三聚体,与TNF适配蛋白形成复合体。RANKL与T细胞依赖性免疫反应有关及在CD4+、CD8+中表达和T细胞的受体刺激是相一致的[2],可耐受性诱导甚至还可能上调肿瘤细胞的抗凋亡通路,在多种癌细胞中均可表达与肿瘤病程相关[3]。本研究发现,EMPD肿瘤组织中RANKL表达的阳性率高达82.5%,提示肿瘤细胞通过RANKL这个媒介诱导其增殖分化,推测在疾病的初始阶段正常组织细胞由于多种因素的影响下发生突变产生Paget细胞,继而激活RANK-RANKL细胞信号通路,在此过程中RANKL通过调节朗格汉斯细胞和T细胞的亚群及M2巨噬细胞以自分泌或旁分泌的形式释放多种多样的炎症细胞因子来诱导Paget细胞的增殖、迁徙或转移,甚至进一步发展突破真皮层或围绕在附属器周围转为侵袭性EMPD。另外,Paget细胞在上述炎症因子、信号通路的多重激发下,通过肿瘤细胞自身的某些产物加强了RANKL的表达或通过级联放大效应促进了免疫耐受、抑制性T细胞的免疫活化甚至介导了肿瘤细胞表面异常免疫屏障等生物学行为来促使免疫抑制微环境的形成,让Paget细胞逃避免疫监测,摆脱了正常的细胞凋亡调控机制而呈特征性的跳跃式生长。
RAS-RAF-MEK-ERK简称为MAPK通路。ERK分为ERK1和ERK2,它们激活是通过MEK催化酪氨酸和苏氨酸残基的磷酸化来实现,它们发挥效应后对细胞增殖和存活过程意义非常大。WANG等[4]发现ERK1/2促进了胃癌的发生、发展,可以作为一个治疗靶点的选择。本研究发现80例EMPD中有69例呈阳性表达,其中强阳性(+++)有36例,这也提示ERK1/2参与了EMPD发生、发展过程。依研究结果推测ERK细胞信号通路促进了Paget细胞的有丝分裂和激素受体信号转导,而且肿瘤细胞不间断持续生长离不开细胞因子、血管淋巴管、营养物质的支持,而ERK信号通路在发生作用的同时也离不开这些要素,Paget细胞在ERK的影响下加速了其增殖、转移、跳跃式生长,部分发展到真皮成为侵袭性EMPD。
mTOR的主要特征是其具有调节细胞的生长、增殖和代谢[5]的作用并作为肿瘤治疗的靶点受到了广泛的关注[6]。mTOR的磷酸化要与相应复合物结合,具有活性后[7]才能进入负调控自噬[8]。有研究发现,一方面,在结肠直肠癌中p-mTOR过表达可能参与疾病的发展,增加癌细胞蛋白分泌、缩短细胞周期,导致癌细胞的无限制增长[9];另一方面,其还可能打乱正常细胞凋亡过程,增加异常细胞存活、血管增生[10],如在乳腺癌中高表达对患者生存预后有着非常不利的影响[11]。p-mTOR信号轴还可能是促进非小细胞肺癌细胞增殖和侵袭的关键分子[12]。本研究中,p-mTOR的表达程度最高达71例,阳性率为88.75%,推测EMPD中Paget细胞生成后借助AKT协调肿瘤细胞有丝分裂信号,通过mTOR影响蛋白质合成,在一定程度上是血管生成、延展的中枢调节因子,可能促进了癌细胞蛋白的分泌。mTOR信号通路激活后让突变而来的Paget细胞在G1、S期阶段调控紊乱脱离正常细胞周期,促使其持续过度生长,可能与异常血管、淋巴增生及在瘤细胞凋亡、侵袭力、转移等方面发挥了重要的作用。
通过计算RANKL、p-ERK1/2和p-mTOR三者在EMPD中阳性表达程度统计得出彼此之间呈正相关,这与以下学者的实验结果基本一致。张凌云等[13]对乳腺癌、JONES等[14]对骨转移肿瘤均提出ERK参与了RANKL诱导肿瘤细胞的增殖、迁徙和转移。王妍等[15]采用流式技术表明恶性肿瘤中RANKL会激活AKT和ERK,同时借助以上3条信号通路来促使病情的变化与发展、增殖与转移。据此可以推测RANKL在EMPD中通过了这2条信号通路激活p-ERK1/2、p-mTOR,促使其高表达,在一定程度上促进了其信号通路的转导、表达,促使Paget细胞的生长、增殖,甚至侵袭和转移。
综上所述,乳房外Paget病中RANKL、p-ERK1/2、p-mTOR的过度表达且呈正相关。提示相关信号通路在病程发生、发展及侵袭转移过程中起着重要作用,可能共同促进了肿瘤细胞的生长、增殖和转移,增加了疾病的侵袭性。