血液病患者产毒艰难梭菌无症状定植和感染相关危险因素的前瞻性研究

王 洁， 杨 靖， 刘晓雷， 强翠欣， 李志荣， 牛亚楠， 曹 静， 赵建宏

艰难梭菌相关性腹泻（Clostridioides difficileassociated diarrhea， CDAD）是艰难梭菌定植肠道后，过度增殖并释放毒素引起的以肠道症状为主要表现的感染性疾病，临床表现可从轻度的自愈性腹泻到严重的伪膜性肠炎[1-2]。

国内针对无症状艰难梭菌定植发生率和危险因素的研究较少，在临床工作中被严重低估。由于血液病患者基础疾病复杂，有多种已知的艰难梭菌感染（CDI）危险因素，如抗生素使用率高、化疗、住院时间长和免疫缺陷等，研究表明白血病或淋巴瘤的血液病患者易发生CDI[3-4]。然而，血液病患者是否容易发生产毒艰难梭菌定植（toxigenicClostridioides difficilecolonization, tCDC）以及发生感染的危险因素尚不清楚。本研究对河北医科大学第二医院血液科住院患者tCDC的发生率和危险因素进行分析，为早期识别和预防隔离提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

2013年3—9月血液病房新入院的患者。纳入标准：年龄≥15周岁，住院时间≥3 d；排除标准：患者入院时被诊断为CDAD，患者入院前2个月内有tCDC或CDAD病史，患者有结肠切除史，需要临终关怀的患者，未签署知情同意书者，入院后48 h内无便者。信息不完整以及中途退出者不纳入分析。本研究经河北医科大学第二医院伦理委员会批准，批准文号为2013L-21。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 收集患者的临床基本信息，包括年龄、基础疾病、Charlson合并症指数、住院史、抗生素使用等。

1.2.2 粪便标本采集 患者在入院48 h内、每周以及随时发生腹泻时分别收集粪便标本，标本在2 h内送至实验室。本研究的主要临床结局是入院后发生CDAD，未发生CDAD的患者追踪至出院或死亡。不采集再次入院血液病患者的粪便标本。

1.2.3 艰难梭菌分离和鉴定 取粪便标本与无水乙醇等比例混合均匀，室温静置1 h，4 000×g离心10 min，取沉淀物接种于艰难梭菌拉氧头孢诺氟沙星（CDMN）选择性培养基（OXOID，Cambridge， UK），37℃厌氧培养 48～72 h。可疑菌落通过 VITEK 2 ANC 卡（Bio Mérieux， Lyon，France）鉴定。

1.2.4 DNA提取和基因检测 提取艰难梭菌的DNA进行PCR扩增检测[5]，包括tcdA、tcdB、cdtA、cdtB、16S rDNA。 反 应 体 系 为 25 μL：2×Taq MasterMix 12.5 μL；DNA 模板 3 μL；ddH2O 9.5 μL。所得产物取6 μL点样于2%～3%的琼脂糖凝胶，电泳条件为100 V电压，80～100 min 后，将胶块置于凝胶成像系统下观察有无特异性扩增的条带。

1.2.5 核糖体分型 检测艰难梭菌16S～23S间隔区的多态性， 所用引物分别来自16S和23S[5]。3%琼脂糖凝胶100 V电泳4 h分离PCR产物，采用100 bp的DNA梯状图对其进行标准化，以艰难梭 菌 RT001（ATCC 9689）、RT012（ATCC BAA-1382）、RT017（ATCC 43598）、RT 027（ATCC BAA-1870）为参考菌株，与参考菌株型别不一致的，本实验室使用HB前缀进行命名。

1.2.6 定义 腹泻定义为24 h内不少于3次不成形便；tCDC定义为培养阳性但无腹泻症状；CDAD定义为患者发生无法用其他原因解释的腹泻同时产毒艰难梭菌培养阳性；医院获得性艰难梭菌定植或感染定义为入院后72 h或更长时间发生的艰难梭菌定植或感染[6]。

1.2.7 统计学分析 使用统计软件SPSS 13.0处理数据。单因素分析：连续型变量使用Student-t检验，结果用均数±标准差表示；分类变量使用χ2检验或Fisher确切检验。多因素分析：采用logistic回归分析。双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 标本采集及菌株分型

7个月期间共180例血液病新住院患者符合入选标准，其中15例拒绝签署知情同意书退出，25例入院后48 h内无便，28例中途退出实验，7例信息不全，最终105例患者纳入研究。共收集218份粪便标本，从29例患者的粪便中筛选出艰难梭菌共45株，均为A、B毒素基因同时阳性[tcdA（+）/tcdB（+）/cdtA（-）/cdtB（-）]，未检出二元毒素基因。核糖体分型为12个型别，RT001和RT012为主要流行型别，占66.7%（30/45），与参考菌株型别不一致的命名为HB，按鉴定的顺序进行编号（图1）。RT001和RT012的多位点序列分型（MLST）基因型分别为ST3和ST54[5]。在这45株菌株中未检测到艰难梭菌RT027型高产毒株。

图1 45株产毒艰难梭菌的PCR核糖体分型Figure 1 PCR ribosomal typing of 45 strains of toxigenic C. difficile

2.2 发病率和临床结局

105例患者，平均年龄46.6岁，男性占49.5%（52/105）。29例患者（27.6%，29/105）有tCDC，其中21例（72.4%，21/29）入院时有无症状tCDC，8例（27.6%，8/29）在入院后发生医院获得性tCDC；29例tCDC患者中6例（20.7%，6/29）在住院期间发生了CDAD，其中4例为入院时有定植者，2例为医院获得性定植者，23例出院前为无症状携带者。另76例患者至出院未发生定植或感染。

2.3 入院时有tCDC的危险因素

单因素分析显示，入院时21例有tCDC患者与84例无tCDC患者相比，入院前2个月内有住院史（66.7%对31.0%，P=0.003）、入院前30 d内有抗生素使用史（61.9%对14.3%，P＜0.001）差异有统计学意义。两组患者在年龄、性别、入院前30 d内糖皮质激素使用史、基础疾病或Charlson 合并症指数差异无统计学意义。见表1。多因素回归分析显示，入院前30 d内有抗生素使用史差异有统计学意义（OR=18.569， 95 %CI：2.604～132.431，P=0.004），是入院时有 tCDC 的独立危险因素（表1）。

表1 105例患者入院时有tCDC与无tCDC的临床特征和多因素回归分析Table 1 Clinical characteristics and multivariable analysis of 105 patients with or without toxigenic C. difficile colonization （tCDC） at the time of admission

2.4 医院获得性tCDC的危险因素

84例患者在入院时无tCDC，入院后有8例（9.5%，8/84）发生医院获得性tCDC。单因素分析显示，两组患者比较，发生医院获得性tCDC的患者年龄高于未发生tCDC的患者（58.2岁对53.2岁，P＜0.001），且住院时间更长（29.0 d对15.0 d，P=0.003）。在治疗用药上，患者入院后使用碳青霉烯类抗生素（37.5%对7.9%，P=0.037）更易发生医院获得性tCDC，使用其他抗生素、化疗药物或质子泵抑制剂（PPI）等差异无统计学意义。见表2。然而多因素回归分析显示，年龄、住院时间、入院后使用碳青霉烯类抗生素等变量差异无统计学意义。

表2 入院时无tCDC的84例患者在入院后发生与未发生医院获得性tCDC患者的临床特征Table 2 Clinical characteristics of 84 patients without toxigenic C. difficile colonization （tCDC） at the time of admission who subsequently developed healthcare-associated tCDC or did not

2.5 发生CDAD的危险因素

单因素分析显示，6例发生CDAD的患者与99例至出院未发生CDAD的患者相比，之前有tCDC（100 %对23.2%，P=0.001）的更容易在住院过程中发生CDAD，住院时间（32.0 d对15.8 d，P=0.003）、入院后使用两种及以上抗生素（66.7%对23.2%，P=0.037）、使用糖肽类抗生素（50.0%对11.1%，P=0.030）差异均有统计学意义。然而多因素回归分析显示，住院时间、使用抗生素等变量差异无统计学意义。

3 讨论

在此前的研究中，健康成人的tCDC发生率为3.6%[5]。一项荟萃分析回顾了北美、欧洲和亚洲入院时无症状tCDC的合并发生率为8.1%（95%CI：5.7%～11.1%）[7]。长期受医疗护理人群中约14.8%是产毒艰难梭菌的无症状携带者[8]。在本研究中有20.0%（21/105）的血液病房新入院患者入院时有tCDC，有7.6%（8/105）发生医院相关性tCDC，因此，血液病房住院患者tCDC发生率为27.6%，高于其他研究报道。本研究选择血液病患者，患者基础疾病复杂，有多种已知的CDI危险因素，如抗生素使用率高、化疗、住院时间长和免疫缺陷等。既往研究报道白血病或淋巴瘤的血液病患者容易发生CDI（OR=2.3，95%CI：1.6～3.2）[3-4]，而引起CDI的危险因素也容易引起tCDC。本研究没有检出其他研究中检出率高的RT027型高产毒株，检出的主要流行型别为RT001（ST3）和RT012（ST54），与河北省健康成年人、健康婴儿和腹泻成人中的流行型别相同[5]。

本研究中，过去2个月内有住院史或过去30 d内有抗生素使用史的患者在入院时有较高的tCDC发生率。过去30 d内有抗生素使用史是入院时有tCDC的独立危险因素。医院是艰难梭菌传播的重要来源，艰难梭菌芽孢可以在环境中长期存在，患者在住院过程中可能会从医院环境中获得艰难梭菌芽孢，然后发生定植，如果成为无症状携带者，再次入院时会向环境中播散芽孢污染环境引起更多的CDI病例[6，9-10]。抗生素暴露，特别是广谱抗生素，它们能破坏肠道微生物群、降低菌群多样性，增加了肠道对艰难梭菌的易感性[11-14]。

单因素分析显示，高龄、住院时间长、使用碳青霉烯类药物治疗的患者更容易发生医院获得性tCDC；使用≥2种抗生素、使用糖肽类抗生素、住院时间长更易发生CDAD。然而可能由于病例数量限制，多因素回归分析显示，上述变量差异无统计学意义，需加大样本量继续研究。

本研究中，6例发生CDAD的患者，住院之前均发生了tCDC。tCDC患者在随后的住院中更容易发生CDAD，这一发现与其他研究结果一致[15-16]。一项系统回顾研究显示，入院时有tCDC的患者发生CDAD的风险是无tCDC患者的5.9倍[7]。有研究发现，与健康受试者相比，无症状的tCDC患者和CDAD患者的肠道微生物菌群丰富性和多样性均降低，然而，这两组的微生物菌群结构并不相同[13]。tCDC患者的微生物菌群丰富性和多样性虽然降低，但降低后菌群结构不足以发生CDAD。随着肠道菌群的进一步破坏和产毒艰难梭菌的过度生长，tCDC患者的肠道菌群更容易发展成为CDAD患者的微生物菌群结构。因此，tCDC是发展为CDAD的必要过程。

综上所述，与其他研究相比，本研究血液病患者tCDC发生率较高。抗生素使用是发生tCDC的独立危险因素，而无症状定植患者更容易在住院过程中发生CDAD。本研究通过研究艰难梭菌定植的发生率和危险因素，为艰难梭菌的筛查和预防提供了依据。