JAK2 V617F基因突变及网织血小板数量在骨髓增殖性肿瘤并发血栓性疾病的研究

伏俊，任静，昝春梅，严富天，李秀萼

(广元市中心医院，1.检验科；2.特检科；3.病理科；4.广元市中医院妇产科，四川 广元 628000)

骨髓增生性肿瘤(myeloproliferative neoplasm，MPN)是克隆性造血干细胞肿瘤，特征为一种或多种骨髓细胞的增殖。大多数疾病影响中老年人群，且发病率逐年增加，易与血栓形成、栓塞或重要器官梗死并发[1]。尽早发现栓塞并及时采取干预措施，对降低患者死亡率意义重大。随着研究的深入，目前发现MPN与个体的遗传学突变密切相关，而JAK2 V617F基因突变位点是目前MPN最为特征性的遗传学突变。国内亦有研究[2]发现，JAK2 V617F突变阳性患者更易罹患血栓栓塞。目前，JAK2 V617F突变已被世界卫生组织( WHO)列为 BCR/ ABL阴性 MPN的主要诊断标准之一[3]。网织血小板由骨髓释放，细胞浆内含有残留RNA，反映骨髓血小板增生的速度[4]。AK2V617F基因位点突变与网织血小板相互结合的检测方法对早期诊断MPN有一定的应用价值。本研究旨在探讨JAK2 V617F基因突变及网织血小板计数与MPN并发血栓性疾病的相关性，为早期的干预治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年2月至2019年2月广元市中心医院收治的132例MPN患者为研究对象，是否并发血栓分为病例组(n=82)和血栓组(n=50)；另选40名同期体检健康志愿者为对照组。病例组中，男性43 例，女性39 例；年龄31.6～75.3 岁，平均(44.7±4.6)岁。血栓组中，男性27例，女性22例；年龄32.8～77.5岁，平均(45.5±4.0)岁；对照组中，男性22名，女性18名；年龄31.4～75.9岁，平均(45.0±3.7)岁。本研究经院伦理委员会批准，所有对象知情同意。三组对象性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。纳入标准：(1)根据“世界卫生组织(WHO)相关MPN 新诊断标准”确诊的患者，包括以下8种类型：慢性髓性白血病BCR/ABL1阳性(CML)、真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)、原发性骨髓纤维化(PMF)、慢性中性粒细胞白血病(CNL)、慢性嗜酸性粒细胞白血病非特质型(nototherwisespecified，CEL)、肥大细胞增多症(mastocytosis)、骨髓增殖性肿瘤未分类型(MPN-U)；(2)年龄>18 岁；(3) 血栓事件经计算机断层扫描、磁共振成像、数字减影血管造影或彩色多普勒超声证实，并由家进一步诊断；(4) 临床资料完整。排除标准：(1)其他类型血液恶性疾病，如原发白血病；(2)其他引起血栓事件的疾病，如骨科手术、妊娠、房颤；(3)严重肝肾脑肺心等脏器功能障碍。

1.2 方法

1.2.1 网织血小板检测 采集研究对象ETDA-K3抗凝全血3 mL，颠倒混匀 5～8 次，采用迈瑞BC- 6900自动血液分析仪检测网状血小板计数，试剂、质控和校准品均为配套(M-68FD染色液批号：2019101404等)。

1.2.2 JAK2V617基因突变检测 (1)DNA提取：采用西安天隆全血基因组DNA提取试剂盒(批号：E01888070251等)提取， 操作严格按试剂盒说明书进行。(2)PCR检测：引物由上海之江生物合成，引物物序列为P5’- CCTCAGAACGTTGATGGCA-3’，P2r5’- ATTGCTTTCCTTTTTCACAACA-3’，Pnf5’-AGCATTTGGT TTTAAATTATGGAGTATATG-3’ 和Pmr5’-GTTTACTTACTCTCGTCTCCACAAAA-3’。扩增条件：95 ℃反应30 s、54 ℃反应25 s、72 ℃反应30 s，共40个循环，最后72 ℃反应10 min 结束。PCR产物经2.5% 琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，产物为453 bp、279 bp (JAK2V617F 突变等位基因) 和 229 bp(野生型等位基因)。所有的实验室检测均在广元市中心医院检验科由具备相应资质的实验室老师完成，实验中所采购和使用的试剂均经过CFDA批准。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 三组网织血小板计数及JAK2V617基因突变阳性率比较

三组网织血小板计数及JAK2V617基因突变阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.05)，且血栓组>病例组>对照组。见表1。

表1 三组对象网织血小板计数及JAK2V617基因突变阳性率比较

2.2 网织血小板计数及JAK2V617基因突变与血栓形成的相关性

相关性分析显示，网织血小板计数及JAK2V617基因突变与血栓形成呈正相关(P<0.05)。见表2。

表2 网织血小板计数及JAK2 V617 基因突变与血栓形成的相关性

3 讨论

随着MPN患者数量的增加，且大多数涉及中老年人，容易出现血栓形成、栓塞或重要器官梗塞等并发症[5]。血小板是由骨髓成熟的巨核细胞所产生，而网织血小板是巨核细胞转化为血小板过程中的一个幼稚阶段，可以反映骨髓血小板增生的速度。本研究结果显示，三组对象网织血小板计数比较，差异有统计学意义(P<0.05)，且血栓组>病例组>对照组，与既往研究[6-7]结果一致，表明MPN患者存在血小板的异常增生，而血小板增多，会导致血液的凝固性增高，易诱发血栓的形成。

半个多世纪以来，通过对骨髓增殖性肿瘤持续研究，除了发现染色体 [t(9.22)(q34；q11)]形成 BCR/ ABL融合基因是MPN特异的分子标记外，而在BCR/ ABL阴性患者(如 ET， PMF)中尚未发现类似的特征性分子生物学指标，也没有发现MPN早期诊断特异性较强的生物学指标，而Baxter等在2005年文献首次发现Janus kinase(JAK)2基因V617F突变存在于MPN患者，成为了此病研究的一大突破[8]。JAK2具备，通过对白细胞介素-3、巨噬细胞集落刺激因子、促血小板生成素、促红细胞生成素、生长因子等多种细胞因子的信号传导调节、促进细胞增殖[9]。多数学者[10]认为，下游相关信号转导分子表达异常是JAK2 基因突变后的主要继发事件，可使一系列细胞产生过度增生，分别向粒细胞、巨核细胞、红细胞分化，最终诱发MPN、血栓病变。在各种造血生长因子受体的信号转导与JAK2V617基因的突变率及网状血小板的生成状态有着紧密的联系，或可促进或调节造血细胞的増殖[11]。本研究结果也显示，三组JAK2V617基因的突变率比较，差异有统计学意义(P<0.05)，且血栓组>病例组>对照组。相关性分析显示，网织血小板计数及JAK2 V617F突变的阳性率呈正相关(P<0.05)，表明网织血小板升高及JAK2V617F突变的阳性率增加，MPN患者发生血栓的风险更大。本研究的不足在于所收集的病例较少，且仅针对的疾病种类有限，今后将进一步扩大样本量，分析JAK2V617基因在多种血液病的突变状况。

综上，MPN患者并发血栓性疾病与网织血小板计数及JAK2 V617F 基因突变有一定的相关性，可能成为评估MPN患者血栓早期发生的实验室检查手段。