结肠癌患者血清微小RNA-205和癌组织E盒结合锌指蛋白1的表达情况及其与放疗敏感性的关系▲

夏宏娟 美丽姑·买买提 徐 丽

(新疆军区总医院肿瘤放疗科，乌鲁木齐市 830000，电子邮箱：xf6m0byp@163.com)

结肠癌是一种消化道恶性肿瘤，年轻人发病率和病死率逐年上升[1-2]。术前放疗是其重要的辅助治疗方式，若放疗不敏感可能会延误患者的手术治疗[3]。组织或细胞中微小RNA(microRNA，miRNA)的表达谱会因射线照射发生变化，最终诱导肿瘤发生，miRNA-205是常见的抑癌基因，在多种肿瘤中特异表达[4-6]。E盒结合锌指蛋白1(zinc-finger E-box-binding homeobox 1,ZEB1)是一种锌指蛋白类转录因子，在多种恶性肿瘤中高表达[7]。有研究显示miRNA-205在ZEB1 3′非翻译区中存在调控结合位点[8-9]，由此推测miRNA-205、ZEB1的表达可能与结肠癌的放疗敏感性有关。本研究探讨结肠癌患者血清miRNA-205、癌组织ZEB1的表达情况及两者与放疗敏感性的关系，以期为临床确定治疗方案提供新思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料 回顾性分析2015年8月至2019年4月本院收治的90例结肠癌患者(结肠癌组)的临床资料。纳入标准：(1)经病理学检查确诊，且均为首次确诊者[10]；(2)临床资料齐全者；(3)保留完整病理组织标本者；(4)肿瘤远端距离肛缘≤10 cm者。排除标准：(1)有细胞分子靶向治疗史患者；(2)有严重心、肝、肾等病变者；(3)有炎症性肠病等结肠病变者；(4)哺乳、妊娠期妇女。患者年龄32～86(60.24±25.48)岁，男性50例、女性40例。另选取84例体检者作为对照组。纳入标准：(1)年龄与结肠癌组相匹配，临床资料齐全；(2)近3个月内未服用过影响体检指标水平的药物，且未接受过影响体检结果的治疗。排除标准同结肠癌组。对照组年龄35～86(60.31±22.48)岁，男48例、女36例。两组的性别、年龄差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。本研究经本院临床研究伦理委员会批准，所有研究对象均自愿参加。

1.2 研究方法

1.2.1 术前放疗方案及其敏感性评定：患者在结肠癌根治术前接受三维适形放疗，放疗前使用多层螺旋CT(购自日本Toshiba公司，型号：Aquilion ONE 320)对原发肿瘤进行5 mm、10 mm层厚连续扫描，采用德国西门子Primus V7直线加速器行6 MV X线照射，选择6～8个共面及非共面视野适度照射，1.8～2.0 Gy/次，两次照射之间间隔1 d，总照射剂量为40～50 Gy，疗程持续2周。根据世界卫生组织制定的标准[11]评定放疗敏感性：放疗后行CT扫描检查，病灶最大径较化疗前增大>20%或出现病灶转移为恶化，放疗后病灶最大径较化疗前减少<30%或增大<20%为稳定，放疗后病灶最大径较化疗前减少≥30%为部分缓解，放疗后病灶消失为完全缓解。9例结肠癌患者中，46例部分缓解或完全缓解,判定为放疗敏感，纳入放疗敏感组；44例稳定或恶化，判定为放疗不敏感，纳入放疗不敏感组。

1.2.2 样品采集及保存：采集结肠癌患者放疗前及体检者体检时的清晨空腹静脉血5 mL，3 000 r/min离心15 min(离心半径15 cm)后收集血清，置于-80℃环境中保存。另取结肠癌患者的结肠癌组织及其中84例患者的癌旁肠黏膜组织(距离病灶组织边缘5 cm左右)作为对照，10%福尔马林固定标本后，进行梯度脱水、透明、浸蜡、包埋及切片(厚度4 μm)，室温保存。

1.2.3 血清miRNA-205表达水平的检测：采用RNA提取试剂盒(购自美国Life Technologies公司，生产批号：AM1556)提取血清总RNA，并采用反转录试剂盒(购自上海杏园瑞民生物工程有限公司，生产批号：XY001180)反转录得到cDNA。实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司(型号：CFX384)。PCR反应体系为包括SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)2 μL(购自日本TaKaRa公司，生产批号：RR820A)，cDNA模板(50 ng/μL)1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL(引物由南京金斯瑞生物科技公司合成，引物序列为:miRNA-205上游引物5′-3′GGAGCGAGGCTTGCTGCAG，下游引物5′-3′GAGACCCTGCTATGCGAGCA；U6上游引物5′-3′CAGGCAGCTCATGGTCATCG， 下游引物5′-3′GACACAGCTCAGGCTGCTAC)，ddH2O 6.2 μL。反应条件为95℃预变性5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法对血清miRNA-205的相对表达水平进行定量分析。

1.2.4 免疫组化法检测结肠癌组织和癌旁肠黏膜组织中ZEB1的表达：采用免疫组化法检测结肠癌组织或癌旁肠黏膜组织标本中ZEB1的表达情况。免疫组化试剂盒购自上海茁彩生物科技有限公司(生产批号：ZC-53964)，ZEB1抗体购自武汉菲恩生物科技有限公司(生产批号：FNab09620)，操作步骤参考聂美楠等[12]的方法。在光学显微镜(购自日本Olympus公司，型号：CX23)高倍镜下(200×)，随机观察5个视野，每个视野计数100个细胞。采用双评分半定量法判定结果，细胞核染色强度评分结果包括3分(强染色，棕褐色)、2分(中染色，黄褐色)、1分(弱染色，浅黄色)、0分(无染色)；阳性细胞占比评分结果包括0分(<25%)、1分(25%～50%)、2分(51%～75%)、3分(>75%)。两项得分相乘>3分视为阳性表达。

1.3 统计学分析 采用SPSS 23.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用成组设计两独立样本t检验或t′检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料以例数和/或百分比表示，比较采用χ2检验；采用Logistic回归模型分析影响结肠癌患者放疗敏感性的因素。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 结肠癌组和对照组之间血清miRNA-205表达水平及不同组织中ZEB1阳性表达情况的比较 结肠癌组、对照组血清miRNA-205的相对表达水平分别为2.52±0.47、1.00±0.23，前者高于后者(t′=27.373，P<0.001)。 癌组织、癌旁组织的ZEB1阳性表达率分别为51.11%(46/90)、14.29%(12/84)，前者高于后者(χ2=26.514，P<0.001)。

2.2 不同临床病理特征结肠癌患者血清miRNA-205相对表达水平、癌组织ZEB1表达情况的比较 90例结肠癌患者中，癌组织ZEB1表达阳性46例，ZEB1表达阴性44例。血清miRNA-205相对表达水平可能与病理类型、局部浸润情况、淋巴结转移情况、TNM分期、肿瘤大体类型及病变部位有关(均P<0.05)。癌组织ZEB1表达情况可能与局部浸润情况、淋巴结转移情况、TNM分期、肿瘤大体类型及病变部位有关(均P<0.05)。见表1。

表1 不同临床病理特征结肠癌患者miRNA-205相对表达水平、ZEB1表达情况的比较

2.3 放疗敏感组和放疗不敏感组血清miRNA-205相对表达水平、癌组织ZEB1表达情况 放疗敏感组血清miRNA-205的相对表达水平及癌组织ZEB1阳性表达率均更低(均P<0.05)。见表2。

表2 结肠癌患者miRNA-205相对表达水平、ZEB1表达情况与放疗敏感性的关系

2.4 影响结肠癌患者放疗敏感性的多因素Logistic回归分析 以结肠癌患者放疗后是否敏感为因变量，以性别、年龄、病理类型、局部浸润、淋巴结转移、TNM分期、肿瘤大体类型、病变部位、血清miRNA-205相对表达水平、癌组织ZEB1表达情况作为自变量(变量赋值见表3)，纳入二元Logistic回归模型中进行多因素分析。结果显示：癌组织中ZEB1表达情况和TNM分期是影响结肠癌患者放疗敏感性的因素(均P<0.05)，其中ZEB1阳性表达、TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期的患者对放疗更不敏感。见表4。

表3 变量赋值情况

表4 影响结肠癌患者放疗敏感性的多因素Logistic回归分析

3 讨 论

结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤，其特点为复发率高和易转移[13]。放疗是结肠癌主要的辅助治疗方式，其敏感性易随相关基因的改变和肿瘤微环境的变化而变化，最终导致肿瘤复发或转移，该现象被称为放疗抵抗[14-15]。因此，评估患者放疗敏感性对于提高治疗效果十分重要。

miRNA与肿瘤的发生、发展密切相关，例如下调miRNA-96表达能抑制结肠癌细胞迁移及侵袭[16]。本研究中，结肠癌组的血清miRNA-205相对表达水平高于对照组，且可能与病理类型、局部浸润情况、淋巴结转移情况、TNM分期、肿瘤大体类型有关(均P<0.05)，由此推测miRNA-205可能通过沉默癌细胞相关因子的表达来影响癌细胞的生长和代谢，影响结肠癌的发病和病情程度。 放疗可诱导癌细胞miRNA发生差异表达[17-19]，而miRNA的表达变化也会影响放疗的效果。例如，Hou等[20]的研究表明，辐射可显著激活胶质瘤细胞系中的自噬并降低miRNA-17-5p的表达水平，且miRNA-17-5p上调使异种移植瘤对辐射敏感；Li等[21]发现，miRNA-320可通过靶向调节Fox M1的表达来增强胶质瘤的放疗效果。本研究结果显示，放疗敏感的结肠癌患者血清miRNA-205的表达水平更低(P<0.05)，这表明miRNA-205的表达或可影响结肠癌患者的放疗敏感性。

ZEB1可通过调控相关蛋白的表达来提高肿瘤细胞的侵袭和转移能力[22-23]。李卫奇等[24]的研究表明结肠癌组织中的ZEB1可能参与结肠癌的发生和发展。本研究结果显示，结肠癌患者癌组织中的ZEB1阳性表达率高于癌旁组织，且癌组织的ZEB1表达阳性情况可能与局部浸润情况、淋巴结转移情况、TNM分期、肿瘤大体类型有关(均P<0.05)。这提示ZEB1可能参与了结肠癌的发生，并促进癌细胞的侵袭和转移等。有研究表明，ZEB1可作为预测食管癌患者放疗敏感性的分子标志物[25]。本研究中，放疗敏感的结肠癌患者的癌组织ZEB1阳性表达率更低(P<0.05)，Logistic回归分析结果也提示癌组织ZEB1阳性表达与结肠癌患者的放疗敏感相关(P<0.05)，这提示ZEB1的阳性表达可能共同参与了结肠癌的放射性抗拒。

综上所述，结肠癌患者的miRNA-205和ZEB1的表达均上调，两者可能共同参与结肠癌的发生、发展，并不同程度地影响放疗敏感性，但具体作用机制有待进一步深入研究。