Tyrosinase和Nestin及CD34在非典型黑素痣组织中的表达及临床意义

[摘要]目的：探讨Tyrosinase、Nestin及CD34在非典型黑素痣组织中表达及意义。方法：收集2012年1月-2019年10月52例非典型黑素痣组织及20例正常皮肤组织。采用EnVision二步法检测Tyrosinase、Nestin、CD34的表达。结果：Tyrosinase和Nestin在交界痣中阳性率为100.0%和0.0%，复合痣中表皮、真皮浅层及真皮深层组织阳性率分别为100.0%，68.4%，0.0%;0.0%，10.5%，89.5%，皮内痣中真皮浅层及真皮深层组织阳性率分别为88.2%，0.0%;29.4%，88.2%，正常皮肤组织阳性率为100.0%，15.0%。非典型黑素痣细胞不表达CD34，正常皮肤组织血管内皮细胞中CD34呈强阳性。复合痣和皮内痣表皮组织痣细胞Tyrosinase阳性率显著高于真皮深层组织（P=0.0300，0.0001）;复合痣和皮内痣真皮浅层痣细胞Nestin阳性率显著低于真皮深层组织（P=0.0001，0.0020）。复合痣和皮内痣的真皮浅层痣细胞中Tyrosinase和Nestin高表达率比较，差异有统计学意义（P=0.0010，0.0020）;复合痣和皮内痣的真皮深层痣细胞中Nestin与Tyrosinase高表达率比较，差异有统计学意义（P=0.0000，0.0001）。结论：非典型黑素痣从表皮、真皮浅层到真皮深层Tyrosinase阳性率逐渐降低，Nestin阳性率逐渐增加，不表达CD34，Tyrosinase/Nestin的表达趋势可解释黑素细胞前体分化、迁移过程。

[关键词]非典型黑素痣;酪氨酸酶;巢蛋白;CD34;干细胞

[中图分类号]R739.5    [文献标志码]A    [文章編号]1008-6455（2021）10-0014-04

Expression and Clinical Significance of Tyrosinase， Nestin and CD34 in Dysplastic Melanocytic Nevi

CHEN Zhao-hui

（Department of Dermatology，the Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830064，Xinjiang，China）

Abstract： Objective  To investigate the expression and significance of Tyrosinase， Nestin and CD34 in dysplastic melanocytic nevi. Methods  52 cases of dysplastic melanocytic nevi and 20 cases of normal skin tissue from January 2012 to October 2019 were collected. The expression of Tyrosinase， Nestin and CD34 were detected by EnVision two-step method. Results  The positive rate of Tyrosinase， Nestin was 100.0%， 0.0% in junctional nevi. The positive rate of Tyrosinase， Nestin were 100.0%， 0.0% in epidermis， 68.4%， 10.5% in superficial dermis and 0.0%， 89.5% in deep dermis of compound nevi. The positive rate of Tyrosinase， Nestin were 88.2%， 29.4% in superficial dermis and 0.0%， 88.2% in deep dermis of intradermal nevi. The positive rate of Tyrosinase， Nestin was 100.0%，15.0% in normal skin tissue. All junctional， compound， and intradermal nevi were negative for CD34 within nevus cells， while normal skin tissues were strongly positive for CD34 in vascular endothelial cells. The positive rate of Tyrosinase in epidermal tissue of compound and intradermal nevi was significantly higher than that in deep dermis （P=0.0300， 0.0001）. The positive rate of Nestin in superficial dermal nevocytes of compound， intradermal nevi was significantly lower than that in deep dermal nevocytes （P=0.0001， 0.0020）. The high expression rates of tyrosinase and nestin in superficial dermal nevus cells of compound nevus and intradermal nevus were statistically significant （P=0.0010， 0.0020）. There was significant difference in the high expression rate of nestin and tyrosinase in deep dermal nevus cells of compound nevus and intradermal nevus （P=0.0000， 0.0001）. Conclusion  The positive rate of tyrosinase and Nestin in dysplastic melanocytic nevi decreased gradually from epidermis， superficial dermis to deep dermis， while the positive rate of Nestin increased gradually. The expression trend of tyrosinase/Nestin can explain the process of melanocyte precursor differentiation and migration.

Key words： dysplastic melanocytic nevi; Tyrosinase; Nestin; CD34; stem cells

非典型黑素痣（Dysplastic melanocytic nevi）是恶性黑素细胞瘤的恶性前病变，分为皮内痣、交界痣及混合痣。恶性黑素细胞瘤与良性痣需要使用免疫组织化学鉴别[1]。虽然一些黑素细胞谱系标记物可用于区别良恶性[2-3]，但这些标记物灵敏度、特异度差，因此寻找到一种更具价值的标记物迫在眉睫。酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）是黑素细胞成熟过程中的主要黑色素生成酶，也是黑素细胞分化程度的特异性标记物。研究发现，表皮或浅表真皮痣细胞高表达酪氨酸酶，而深层皮肤小痣细胞低表达酪氨酸酶[4]。近年来发现，肿瘤干细胞在黑素瘤发生发展中起到重要的作用[5]。Nestin、CD34作为肿瘤干细胞标记物，在神经脊干细胞及神经细胞高表达[6]。但是黑素细胞痣如何转变为黑素细胞瘤的研究知之甚少。因此，本研究检测了获得性非典型黑素痣及正常皮肤组织中Tyrosinase、Nestin及CD34的表达，以期为黑素细胞瘤的早期诊断寻找到一种标记物。

1  资料和方法

1.1 临床资料：收集2012年1月-2019年10月在笔者医院明确诊断为非典型黑素痣的52例患者的病理及临床资料。所有标本均取自手术或活检。其中交界痣16例，复合痣19例和皮内痣17例;部位：背部40例，下肢3例，上肢3例，头颈部6例;男30例，女22例;年龄15～73岁，平均（40.5±9.3）岁。选取同期正常人群20例为对照组，男11例，女9例;年龄15～67岁，平均（39.2±8.4）岁。正常皮肤标本取自眼睑、外耳道和胸部。阳性对照乳腺癌标本来自笔者医院病理科保存标本。本研究得到了入选对象的知情同意，并征得医院伦理道德委员会的批准。

1.2 免疫组化检测Tyrosinase、Nestin及CD34蛋白表达：制备4μm厚连续切片，脱蜡并修复抗原，采用EnVision二步法检测Tyrosinase、Nestin、CD34的表达，严格按照试剂盒说明书进行，加入兔抗人Tyrosinase、Nestin、CD34多克隆一抗（1：100，1：100，1：50），4℃冰箱过夜，PBS洗涤后加入二抗，PBS洗涤，DAB显色，水洗，苏木素复染，脱水，二甲苯透明，封片。阳性对照采取乳腺癌切片， 阴性对照用正常血清代替抗体。免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物有限公司，兔抗人Tyrosinase、Nestin、CD34多克隆抗体购自美国Sigma公司，鼠抗兔单克隆二抗购自美国Sigma公司。Tyrosinase、Nestin、CD34蛋白定位于细胞浆，均以胞质呈红色为阳性染色细胞。高倍镜下选取5个随机视野，观察1 000个细胞，按照阳性细胞比例分为：<10%（0分）;10%～49%（1分）;50%～89%（2分）;≥90%（3分）。按照阳性细胞染色强度分为：阴性（0分）;弱阳性（1分）;中等阳性（2分）;强阳性（3分）。计算阳性细胞比例×阳性细胞染色强度，规定0～6分为低表达，7～12分为高表达。所有切片均由病理科副主任医师以上职称的同一医生双盲阅片，重复三次，取平均值。

1.3 统计学分析：使用SPSS 20.0软件进行统计分析，计数资料采用（n，%）表示，χ2检验进行组间比较。采用四格表对Tyrosinase和Nestin表达的相关性进行分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 Tyrosinase、Nestin、CD34蛋白表达情况：Tyrosinase蛋白在黑素细胞痣组织中呈巢状或团状分布。16例交界痣中Tyrosinase陽性率为100.0%，阳性细胞位于表皮真皮交界处，呈团状分布（见图1）;19例复合痣中表皮、真皮浅层及真皮深层组织Tyrosinase阳性率分别为100.0%，68.4%，0.0%，染色强度逐渐减弱（见图2）;17例皮内痣中真皮浅层及真皮深层组织Tyrosinase阳性率分别为88.2%，0.0%，染色强度逐渐减弱（见图3）。20例正常皮肤组织中Tyrosinase阳性率为100.0%，阳性细胞位于表皮基底层，呈巢状分布（见图4）。

16例交界痣中Nestin阳性率为0.0%（见图1）;19例复合痣中表皮、真皮浅层及真皮深层组织Nestin阳性率分别为0.0%，10.5%，89.5%，染色强度逐渐增强（见图2）;17例皮内痣中真皮浅层及真皮深层组织Nestin阳性率分别为29.4%，88.2%，染色强度逐渐增强（见图3）。正常皮肤组织及获得性非典型黑素痣血管周围可见Nestin强阳性（见图4B，5A）。获得性非典型黑素痣毛囊的隆突部位Nestin强阳性（见图5A）。

获得性非典型性黑素细胞不表达CD34，而在血管内皮细胞、痣巢周围结缔组织的基质细胞及毛囊的隆突部位可观察到CD34的强阳性表达（见图5B，6）。正常皮肤组织血管内皮细胞中CD34呈强阳性（见图4C）。

复合痣和皮内痣表皮组织Tyrosinase阳性率显著高于真皮深层组织，差异有统计学意义（P=0.0300，0.0001）。复合痣和皮内痣真皮浅层Nestin阳性率显著低于真皮深层组织，差异有统计学意义（P=0.0001，0.0020）。见表1。

3  讨论

酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）是一种含双核金属铜的氧化还原酶，是黑色素合成过程的限速酶。研究显示，酪氨酸酶在黑素瘤组织中呈阳性表达，且表达强度随黑素瘤的恶性程度的提高而增加[7]。另外研究表明，黑素瘤患者外周血Tyrosinase水平高于正常人群，与患者的生存率呈负相关[8]。本研究采用免疫组织化学方法检测了交界痣、复合痣和皮内痣组织Tyrosinase的表达，结果显示，Tyrosinase在交界痣组织中阳性率最高，复合痣次之，皮内痣最低。现已证实，部分黑素瘤是由黑素细胞痣恶变而来，交界痣比皮内痣易恶变，本研究结果提示Tyrosinase可能与痣细胞恶变过程有关，通过检测Tyrosinase可早期预测痣细胞的恶变。

恶性黑素瘤是起源于神经嵴的黑素细胞的高度恶性肿瘤，研究发现，黑素瘤中存在一定数量的肿瘤干细胞，在黑素瘤发育前期，肿瘤干细胞周期进行的非常缓慢，称为恶变前肿瘤干细胞[9]。这群细胞受到紫外线照射、损伤等作用后可发生突变，形成恶性黑素瘤干细胞。Nestin作为神经来源干细胞的标记物，在多种肿瘤干细胞高表达，Akiyama等发现，CD133和Nestin在恶性黑素瘤组织中阳性表达率均高于黑素细胞痣[10]。Tyrosinase是黑素细胞成熟的标记物，而Nestin则提示黑素细胞不成熟的标记物，本研究结果显示，表皮和真皮浅表痣细胞中Tyrosinase高表达，Nestin低表达，而真皮深层痣细胞Tyrosinase低表达，Nestin高表达，存在一定的相关性，提示Tyrosinase和Nestin可作为从多能性黑素细胞前体到成熟黑素细胞的标记物，据此笔者推测黑素细胞痣中Tyrosinase/Nestin的分布可以作为一种“病理组织学模式”来监测痣细胞在病理性增殖的情况下的分化状态。

正常皮肤组织中，虽然大多数细胞是分化成熟的黑素细胞，但仍有多能干细胞存在于真皮、毛囊的隆起区域和表皮中。最近研究发现，毛囊的突起区域存在一群神经嵴来源的干细胞，在体外可分化为黑素细胞[11]。本研究结果显示，毛囊突起区域的小细胞聚集物高表达干细胞标记物Nestin和CD34，提示这群细胞可能是神经嵴来源的黑素细胞干细胞的贮存库。推测黑素细胞干细胞沿着周围神经或血管，在真皮和毛囊的突起区域聚集。这群细胞被激活后，如果不发生突变，则向表皮迁移，分化为正常黑素细胞;如果发生突变，他们会异常增殖和迁移，从而形成痣细胞，甚至恶变。

综上所述，Tyrosinase、Nestin在交界痣、复合痣和皮内痣不同部位表达有差异，Tyrosinase联合Nestin检测可用于黑素细胞瘤疑难病例的诊断。同时分析Tyrosinase、Nestin在黑素细胞痣中的分布可以提供一个“组织病理学模式”，有助于追踪神经嵴衍生的黑素细胞前体向其最终解剖和功能部位进入的分化途径。

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[收稿日期]2020-08-17

本文引用格式：陈赵慧.Tyrosinase和Nestin及CD34在非典型黑素痣组织中的表达及临床意义[J].中国美容医学，2021，30（10）：14-17.