瘢痕疙瘩组织中miR-22-5p的表达及与eIF4E的相关性研究

王荣坤　林简

[摘要]目的：观察瘢痕疙瘩组织中微小RNA-22-5p（miR-22-5p）和真核细胞翻译起始因子4E（eIF4E）的表达，分析其相关性及临床意义。方法：选择51例瘢痕疙瘩组织作为观察组，51例增生性瘢痕组织作为对照组，51例正常皮肤组织作为正常对照组。应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测三组中miR-22-5p的表达，应用免疫组化法和Western Blot法检测瘢痕疙瘩组织中eIF4E的表达。结果：观察组中miR-22-5p的表达明显低于对照组和正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。miR-22-5p的表达在不同病变最大径、增殖指数和有无家族史中的表达差异有统计学意义（P<0.05）;而在不同性别、年龄中的表达差异无统计学意义（P>0.05）。瘢痕疙瘩中miR-22-5p与eIF4E呈负相关。结论：MiR-22-5p在瘢痕疙瘩中的表达下降，与临床及病理特征有关，miR-22-5p与eIF4E可能具有协同负向作用。

[关键词]瘢痕疙瘩;增生性瘢痕;微小RNA-22-5p;真核细胞翻译起始因子4E;相关性分析

[中图分类号]R619+.6    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2021）10-0010-04

Expression Significance of miR-22-5p and Relationship with eIF4E in Keloid Tissue

WANG Rong-kun，LIN Jian

（Department of Dermatology & STD，Sanya People's Hospital，Sanya 572000，Hainan，China）

Abstract： Objective  To observe the expression of microRNA-22-5p （miR-22-5p） and eukaryotic translation initiation factor 4E（eIF4E） in keloid tissue， and analyze their correlation and clinical significance. Methods  51 cases of keloid tissue were selected as the observation group， 51 cases of hypertrophic scar tissue were selected as the control group， 51 cases of normal skin tissue were selected as the normal control group. The expression of miR-22-5p was detected by real-time quantitative PCR （qRT-PCR） in three groups The expression of eIF4E was detected by immunohistochemistry and Western blot in keloid tissue. Results  The expression of miR-22-5p in the observation group was significantly lower than that in the control group and the normal control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. There were significant differences in the expression of mir-22-5p in the maximum diameter of different lesions， proliferation index and family history （P<0.05）. However， there was no significant difference in expression between different genders and ages （P>0.05）. Negative correlation was found between miR-22-5p and eIF4E in keloid. Conclusion  The expression of miR-22-5p is decreased in keloid， which is related to the clinical and pathological characteristics. MiR-22-5p and eIF4E may have synergistic negative effect.

Key words： keloid; hypertrophic scar; microRNA-22-5p; eukaryotic translation initiation factor 4E（eIF4E）; correlation analysis

瘢痕疙瘩是皮膚创伤愈合过程中由于成纤维细胞异常增殖、胶原过量沉积形成的增生性疾病，目前学者关注到分子遗传因素异常对其形成具有调控作用[1]。真核细胞翻译起始因子家族相关成员是近年关注到的与病理性瘢痕形成密切相关的因子，其通过调节细胞增殖、调控细胞侵袭及胶原形成起作用，真核细胞翻译起始因子4E（Eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E）是家族中的重要成员，近年其在肿瘤的侵袭性生长中的研究较多。学者发现eIF4E高表达可能与成纤维细胞增生性疾病密切相关[2]。eIF4E上游具有多种调控基因，通过生物信息检索发现miR-22-5p可能是其调控的上游因子（见图1），同时相关文献中发现miR-22-5p低表达可能是促进细胞侵袭的重要因子[3]。基于此本实验应用实时荧光定量PCR法（qRT-PCR）检测瘢痕疙瘩中miR-22-5p的表达，分析其表达的临床意义，探讨其与eIF4E表达的相关性，以期为研究瘢痕疙瘩的形成和进展提供实验数据。

1  资料和方法

1.1 临床资料：选择2018年1月-2020年9月确诊为瘢痕疙瘩的51例患者作为观察组，其中男27例，女24例，年龄20～56岁，中位年龄36岁。纳入标准：①病变超出原创口，边缘呈“蟹足肿”样突起，质地硬，呈粉红色或紫红色，无弹性，血供差。镜下可见较多的成纤维细胞，并可见嗜酸性透明样胶原纤维，具折光性，胶原纤维方向较不规则，呈漩涡状与周围皮肤分界清楚，并经病理医师阅片后证实（见图2），呈浸润性生长，且无消退现象;②首次确诊;③临床及病理资料齐全。排除标准：①诊断有异议者;②切取组织前行放疗者;③随访资料不全或家属不同意观察者。本组中选择51例增生性瘢痕组织作为对照组，均取自皮肤烧伤患者行整形修复时的增生性瘢痕组织，其中男28例，女23例，年龄24～67岁，中位年龄38岁。选择51例正常皮肤组织作为正常对照组，均取自皮肤表面或皮下良性肿物切除术时皮肤切缘处经病理证实为正常皮肤组织的患者，其中男29例，女22例，年龄22～60岁，中位年龄37岁。标本术后立即取材，置于-80℃冰箱中冻存待检。三组性别、年龄比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。研究经医院伦理委员会批准，患者或家属签定知情同意书。

1.2 实验方法

1.2.1 qRT-PCR检测miR-22-5p水平：应用qRT-PCR法检测miR-22-5p的表达。取术后留取的新鲜标本约10g，应用TRizol试剂提取总RNA后，逆转录法合成cDNA，按照相应qPCR试剂盒的说明书检测miR-22-5p水平。MiR-22-5p上游引物：5'-GTATCACACGTTGCATCCTCT-3';下游引物：5'-GACTACGCACGGAACTACCCC-3'。以U6为内参，引物上游：5'-GGAAGTAGCACCTGATACGTC-3'下游：5'-TTGGCTTGTACGAATCTTCCG-3'。扩增反应条件：95℃预变性5min;95℃ 10s，60℃ 20s，72℃ 10s，33个循环。循环结束后进行熔解曲线，于60℃～95℃进行测定，条件设置为升温幅度0.5摄氏度/次，5秒/次，采用2-△△Ct法计算相对表达水平。

1.2.2 eIF4E表达的检测：应用免疫组化二步法检测瘢痕疙瘩组织中eIF4E的表达。eIF4E购自上海碧云天生物技术公司。基于石蜡包埋组织，切取4μm切片，先行预实验，选择1：250的浓度进行正式实验。正式实验均由同一病理科技师一次性完成，严格按照实验步骤操作，行DAB显色，同时设阳性对照和阴性对照。eIF4E的阳性部位是细胞质和（或）细胞膜。选择5个400倍视野（热点区）进行观察。实验结果由两位病理医师双盲阅片后得出。分别进行阳性率和着色强度的记分。阳性率：≤5%记1分，6%～25%记2分，26%～50%记3分，>50%记4分。着色强度：无着色记0分，淡黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分。两者相乘作为最终评分，分值为0～12分。以≤6分记为阴性，以>6分记为阳性，计算阳性率。

应用Western Blot法检测瘢痕疙瘩组织中eIF4E的表达。GAPDH为内参。基于新鲜冻存组织。严格按实验步骤进行蛋白提取、蛋白浓度测定、蛋白变性、加样、电泳、电转膜、免疫杂交后，取出膜后加入超敏发光液，发光时间2min。X胶片盒曝光2min，显影25s。应用Image J分析，以eIF4E与GAPDH的比值作为相对表达量进行数据分析。

1.3 统计学分析：数据分析应用SPSS 17.0完成，定量资料应用均数±标准差表示，行方差齐性检验，两组间的比较应用独立样本的t检验，多组间比较应用方差分析;组间率的比较应用卡方检验，数据应用Spearman相关分析，均以P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 三组间miR-22-5p表达比较：瘢痕疙瘩中miR-22-5p的表达量明显低于对照组和正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1、图3。

2.2 miR-22-5p在不同临床特征分组中表达比较：miR-22-5p的表达在不同病变最大径、增殖指数和家族史中的表达中差异有统计学意义（P<0.05）;而在不同性别、年龄的表达中差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.3 瘢痕疙瘩中miR-22-5p与eIF4E的相关性：免疫组化法检测到eIF4E的阳性率是15%～55%，平均为37.7%。相关分析显示miR-22-5p与eIF4E呈负相关性（r=-0.68，P=0.036）。Western Blot检测到eIF4E的表达为0.5～2.6，平均为1.5。相关分析显示miR-22-5p与eIF4E呈负相关性（r=-0.58，P=0.044）。見图4～5。

3  讨论

miRNAs是在RNA沉默和基因表达转录后调节中起作用的长度为19～24个核苷酸的小非编码RNA[4]。最近研究报道，miRNAs参与多种疾病的形成，尤其是细胞生长、增殖及侵袭中。miRNAs参与基因转录后水平调控，miRNAs的序列具有高度的物种保守性，其表达具有独特的时间特异性和空间特异性[5]。人类基因的30%受miRNAs调节，每个miRNAs平均具有200个靶mRNA。有些miRNAs靶向参与细胞侵袭和浸润性生长的mRNA，被称为侵袭抑制miRNAs[6]。miRNAs主要通过靶向调控下游靶基因发挥生物学作用[7]。本研究前期参照肿瘤侵袭的研究，分析与侵袭性生长有关的miRNAs，发现并筛选出miR-22-5p作为本研究关注的因子，同时应用生物信息学发现miR-22-5p与eIF4E具有靶向结合位点。相关资料显示具有侵袭性生长的病变组织中miR-22-5p低表达而eIF4E高表达[8-9]。miR-22-5p可能作为抑制细胞侵袭的因子发挥生物学作用[10]。

本研究结果显示瘢痕疙瘩中miR-22-5p的表达明显低于对照组和正常对照组，提示miR-22-5p低表达是瘢痕疙瘩病变形成的重要分子因素。结果显示miR-22-5p的表达在不同病变最大径、增殖指数和家族史中的表达中差异有统计学意义，提示miR-22-5p低表达参与瘢痕疙瘩的生长过程，也预示miR-22-5p低表达患者具有家族遗传倾向。研究显示瘢痕疙瘩中miR-22-5p与eIF4E具有负相关性，提示二者具有负向协同作用，此结果进一步证实了TargetScan数据库中发现的二者具有结合位点的结构特征。miR-22-5p有参与纤维化和成纤细细胞生长疾病的过程。miR-22-5p通过eIF4E调控瘢痕疙瘩成纤维细胞的细胞外基质分泌，本实验发现了两者的相关性，但是两者是否具有靶向调控作用后续实验中要进行细胞学实验，并通过双荧光素酶报告基因实验进行直接验证，这可能是揭示瘢痕形成重要机理之一。近年学者对真核细胞翻译起始因子家族的相关成员与瘢痕疙瘩的形成较为关注，并发现涉及多种分子生物学通路[11-14]，这些通路均与DNA、RNA及蛋白的表达失调有关。研究认为翻译失调是瘢痕疙瘩病变的基础，翻译起始是蛋白合成中最復杂的步骤之一，涉及多种翻译起始因子和多种mRNA调控元件[15]。翻译起始可以通过多种方式失调，其中最值得注意的是通过MAPK和PI3K/AKT/mTOR等信号通路直接导致翻译失调，启动纤维细胞的异常增生和胶原化。eIF4E在侵袭性肿瘤性病变中高表达，在机体内发现有两种启动子，外部启动子产物为eIF4E，但是当其甲基化后则影响后续的转录作用[16]。miR-22-5p在正常皮肤中高表达可能是保护作用，防止胶原化的损伤[17-18]。miR-22-5p的作用途径和通路可能更多，如对长链非编码RNA MEG3的调控等[19]，因此miR-22-5p的功能表现为在多角度调控细胞的生长和侵袭中，进行系统性细胞学实验对详细研究其功能有重要意义。

总之，miR-22-5p在瘢痕疙瘩组织中的表达下降，与临床病理特征有关，miR-22-5p与eIF4E可能具有协同负向作用。

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[收稿日期]2020-10-09

本文引用格式：王榮坤，林简.瘢痕疙瘩组织中miR-22-5p的表达及与eIF4E的相关性研究[J].中国美容医学，2021，30（10）：10-13.