血清外泌体miR-122 及miR-194 在心肌梗死患者中诊断早期心衰的价值

孙晓燕，亓良森，赵海鸿，周洪伟，马 靖

1 北京市大兴区中西医结合医院 内三科，北京 100076；2 解放军总医院第二医学中心 健康医学科，北京 100853

作为多种心血管系统疾病的终末期，心力衰竭长期预后总体较差，正成为全球范围内的公共医疗负担[1]，多种危险因素与心力衰竭患病率和发病率密切相关，包括年龄、肥胖、糖尿病和高血压，以及既往心血管疾病特别是急性心肌梗死[2]，急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)发生时常伴随左心室形态、大小以及室壁厚度的改变，即左心室重构；左心室重构会进一步引发恶性心律失常或心力衰竭，进而增加患者死亡率[3]。急诊经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI) 是目前临床上治疗急性心肌梗死特别是伴有ST 段抬高型心肌梗死的有效方式，可以快速改善患者梗死部位的血流供应，但术后易发生心力衰竭，不利于血运再建并最终影响患者预后[4]。因此尽早发现和诊断AMI 后心衰并进行有效干预有利于提高患者获益。目前临床上诊断心力衰竭的标准之一是检测血液中N-末端脑钠肽前体(N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP)水平，NT-proBNP 在心室容量负荷以及室壁张力增大、心肌缺血时会大量合成和分泌，且其表达水平与心衰严重程度之间存在显著正相关，属于心力衰竭诊断和预后预测的关键评价指标[5]。外泌体是广泛存在于人体内多种体液中的一种特殊物质，由于其所包含的微小RNA(microRNA，miRNA)可通过对细胞凋亡的调控实现对血管内皮细胞的功能调节，在心血管疾病调节中发挥重要作用[6]，在病理条件下会发生显著变化，因此也属于潜在的活检指标之一。其中miR-194、miR-122 分别是富集于肾和肝的外泌体miRNA，临床研究均证实AMI 患者miRNA 与正常人相比存在差异表达，但两者表达水平与NTproBNP 浓度以及心衰严重程度之间是否存在相关性仍需进一步研究[7]。本研究以AMI 患者作为研究对象，探讨血清外泌体miR-122 及miR-194 在心肌梗死早期的动态变化及两者对早期心衰的诊断价值，旨在为微小RNA 在AMI 后心衰发病过程中作用机制以及该疾病的诊断治疗、预后评估提供参考价值。

对象和方法

1 研究对象 将北京市大兴区中西医结合医院2018 年1 月-2020 年6 月收治的96 例急性心肌梗死患者作为研究对象。所有研究对象均在知情同意书上签字，且本研究得到北京市大兴区中西医结合医院伦理委员会批准。纳入标准：1)诊断为AMI 且于发病12 h 内接受PCI 术治疗[8]；2)心力衰竭患者诊断标准：①表现出疲乏及不同程度呼吸困难等新发心力衰竭典型临床症状；②有心率加快或奔马律、肺部湿啰音、颈静脉充盈或怒张、肢体水肿等体征；③胸部X 线检查结果显示胸腔积液、肺淤血或肺水肿；④出现心源性休克[9]；3)无认知功能障碍且年龄 ≥ 18 周岁。排除标准：1)合并严重肝、肾功能不全或全身性炎症者；2)存在严重心力衰竭、风湿性心脏病、心肌梗死或心脏瓣膜病等病史；3) 患有先天性心脏病、主动脉夹层；4)患有全身血液疾病、恶性肿瘤或自身免疫性疾病；5)一年内接受重大外科手术或创伤；6)既往接受过冠脉支架置入术。

2 研究方法将入选的96例研究对象根据AMI 后是否发生心力衰竭，分为AMI 后发生心力衰竭组(35 例)和未发生心力衰竭组(61 例)。检测并比较两组患者术后1 h 以及发病后12 h、20 h、24 h 和48 h 静脉血血清miR-122、miR-194 水平以及NT-proBNP 浓度，并采用Pearson 相关性分析法分析血清miR-122、miR-194 水平与NT-proBNP浓度之间的相关性。采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC) 分析患者各时间点的miR-122、miR-194 表达水平对心衰发生的诊断价值。同时收集两组患者一般临床资料并进行比较，主要包括性别、年龄、体质量指数(body mass index，BMI)、血压、再灌注时间(指患者AMI 发病至球囊扩张时间)、肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate，eGFR) 以及高血压、糖尿病、高脂血症、心绞痛等病史。

3 血清miR-122、miR-194 水平检测 采用逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测血清miR-122、miR-194 水平，并比较两组患者PCI 术后1 h 以及发病后12 h、20 h、24 h 和48 h 的miR-122、miR-194 水平。分别于各时间点采集4 mL 外周肘静脉血，静置1 h 后3 000 r/min 离心10 min，取上清液保存于-80℃条件下，待测。按照RNAisoTMPlus 试剂盒步骤提取总RNA，miR-122、miR-194 以及内参U6 引物探针由上海闪晶分子生物有限公司提供，引物序列见表1。采用miRNA 逆转录试剂盒(Takara 公司) 逆转录miRNA 并进行PCR 扩增，反应条件为95℃预变性5 min，95℃变性20 s，60℃退火20 s，共50 个PCR 循环。采用ABI Prisme Step-one 荧光定量PCR 仪(Applied Biosystems AB)进行检测以2-△△ct表示miR-122、miR-194 相对表达量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

4 NT-proBNP 浓度检测 分别采集所有患者术后1 h 内以及发病12 h、20 h、24 h、48 h 外周静脉血5 mL 置于含有抗凝剂(EDTA)的真空采血管中，采用免疫荧光法检测全血NT-proBNP 浓度(分别计为P1～P5)，检测试剂盒购自深圳微点生物技术有限公司，测定的浓度范围为5～5 000 pg/mL。

5 统计学分析 采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析。计数资料以百分比(%) 表示，采用χ2检验。计量资料以表示，两组间比较采用独立样本t检验，多时点观测资料比较采用重复测量方差分析。采用Pearson 相关检验分析血清miR-122、miR-194 表达水平与NT-proBNP 浓度之间的相关性。采用ROC 分析探讨血清miR-122、miR-194水平对预测心力衰竭发生的诊断价值。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

结果

1 两组临床资料比较 两组患者的年龄、性别、体质量指数、eGFR、既往病史以及血压等一般临床资料大体相近(P＞ 0.05)；但AMI 后发生心力衰竭组再灌注时长长于未发生心衰组(P＜ 0.001)。见表2。

表2 两组患者一般及临床资料比较Tab.2 Comparison of general and clinical data between the two groups

2 两组NT-proBNP 及miR-122、miR-194 水平动态比较 经整体分析(两因素重复测量方差分析)知各指标的组间、时间及交互作用的整体差异均有统计学意义(P＜ 0.05)。两两比较并结合主要数据分析，组内比较：两组术后1 h 以及发病后12 h、20 h、24 h 和48 h 静脉血血清NT-proBNP浓度和miR-194 水平均呈先上升后下降趋势，并于发病后24 h 达到峰值的单峰趋势，miR-122 水平呈现先下降后上升趋势，发病后24 h 时间点相对表达水平最低；组间比较：除术后1 h 时间点外，AMI 后发生心力衰竭组患者各时间点的血清NT-proBNP 浓度、miR-194 水平均高于未发生心衰组，miR-122 水平低于未发生心衰组，差异均存在统计学意义(P＜ 0.05)。见表3。

表3 两组血清NT-proBNP 及miR-122、miR-194 水平动态比较Tab.3 Dynamic changes of serum NT-proBNP concentration and miR-122 and miR-194 levels between the two groups

3 miR-122 与NT-proBNP 相 关性 分析 Pearson相关性分析结果显示血清miR-122 表达水平与NT-proBNP 呈负相关(r=-0.667，P=0.012)，血清miR-194 表达水平与NT-proBNP 呈正相关(r=0.854，P=0.004)。见图1、图2。

图1 miR-122 与NT-proBNP 相关性分析Fig.1 Correlation analysis between miR-122 and NT-proBNP

图2 miR-194 与NT-proBNP 相关性分析Fig.2 Correlation analysis between miR-194 and NT-proBNP

4 各时间点血清miR-122、miR-194 水平对心力衰竭诊断价值分析 将AMI 后是否发生心力衰竭表征为二分类变量(未发生=0，发生=1)，对血清miR-122、miR-194 水平预测心力衰竭发生的诊断价值进行ROC 分析。结果显示，除AMI 患者术后1 h miR-122 和miR-194 水平对心衰不具有较佳诊断价值外，其余时间点的miR-122、miR-194 水平对于心衰均具有较高的诊断价值，且以发病后12 h 诊断价值最高，ROC 曲线下面积分别为0.941(95%CI：0.901～0.965)、0.867(95%CI：0.829～0.906)。见图3、图4、表4。

表4 各时间点血清miR-122、miR-194 水平对心力衰竭诊断价值Tab.4 Diagnostic value of serum miR-122,miR-194 for heart failure

图3 各时间点血清miR-122 水平诊断心力衰竭诊断的ROC 曲线Fig.3 ROC curve of serum miR-122 level in the diagnosis of heart failure at each time point

讨论

外泌体最早发现于1983 年，具有双层囊泡样结构，通过细胞的内吞、融合、外排的形式形成，其直径为30～150 nm[10]。外泌体被多种细胞分泌，并且其内部包含核酸、脂质、特异性蛋白等细胞间的信息分子，最早被认为是细胞排泄的废弃物[11-12]。近年来随着对外泌体miRNA 认知的不断发展和进步，发现外泌体携带的miRNA 在AMI、心力衰竭等心血管疾病的发生和进展过程中发挥重要作用[13]。AMI 发生后会导致心肌急性缺血甚至坏死，因此心脏收缩力下降、顺应性减弱，进而造成心率加快、心肌牵张以及心脏室壁张力负荷升高，从而引发BNP 呈爆发式合成及分泌[14]。以往大量临床研究已经证实AMI 发生后检测患者血清BNP 浓度对病情评估、临床治疗方案选择以及患者预后预测具有重要指导价值。但BNP 检测时间点选取至关重要，选取合适的检测时间点有利于提高检测效率和避免资源浪费，更重要的是可以避免检测时间点选取过晚造成干预措施不及时导致的患者病情延误[15]。

miR-122 是一种在肝中高表达的miRNA，占据肝中miRNA 含量70% 左右。近年有研究证实，miR-122-5p 也参与了心衰等心脏疾病的发生和发展。徐泽民等[16]通过高通量测序法对心肌梗死后心衰大鼠心肌组织中的miRNA 表达谱进行检测，研究发现心衰大鼠心肌中的miR-122 表达量相较于健康大鼠显著下降，并通过进一步研究证实了miR-122-5p 的促凋亡作用。国外有学者通过qRT-PCR 法对急性心衰患者血清中miR-122 的表达水平进行检测，证实miR-122 的表达水平呈明显下降趋势，且与心衰病程进展程度存在显著负相关(P＜ 0.05)[17]。本研究发现，两组患者术后1 h 以及发病后12 h、20 h、24 h 和48 h 静脉血血清NT-proBNP 浓度和miR-194 水平均呈先上升后下降趋势，并于发病后24 h 达到峰值的单峰趋势；miR-122 水平呈现先下降后上升趋势，发病后24 h 时间点相对表达水平最低。且除术后1 h，AMI 后发生心力衰竭组血清NT-proBNP 浓度以及miR-194 水平高于未发生心衰组，miR-122 水平低于未发生心衰组，差异均存在统计学意义(P＜0.05)。经分析，NT-proBNP 该表达趋势可能与其在AMI 后的特殊合成分泌机制有关，正常人体内的少量BNP 以 BNP 前体(proBNP)形式储存于心房分泌颗粒中，且血循环中BNP 浓度一般为10 pg/mL以下，AMI 发生后心房分泌颗粒中proBNP 发生快速裂解并释放入血，表现为早期BNP 升高；AMI 后期发生心肌坏死，左心室舒张末期压力大大升高，室壁张力以及心室容量负荷增大，进一步刺激心室中大量BNP 的合成与释放[18]。Pearson相关性分析结果显示血清miR-122 表达水平与NT-proBNP 呈显著负相关，血清miR-194 表达水平与NT-proBNP 呈显著正相关(r=-0.667，P=0.012；r=0.854，P=0.004)。推测AMI 发生后外泌体miR-122 及miR-194 浓度动态演变规律可能具有相似的分泌机制，但具体分泌机制仍有待进一步研究。

ROC 曲线分析结果显示，除AMI 患者术后1 h miR-122 和miR-194 水平对心衰不具有较佳诊断价值外，其余时间点的miR-122、miR-194 水平对于心衰均具有较高诊断价值，且以发病后12 h诊断价值最高，ROC 曲线下面积分别为0.941(95%CI：0.901～0.965)、0.867(95%CI：0.829～0.906)，显著高于各单项检测(P＜ 0.05)，诊断效能最佳，同时具有较高的敏感度和特异性。提示不同时间点的miR-122、miR-194 水平诊断心衰的诊断价值存在差异，临床上若采用上述血清学指标对AMI 超早期(术后1 h)是否发生心衰进行诊断，诊断效能较低，容易发生漏诊或误诊情况。临床医生在该阶段应密切观察患者临床症状以及体征，并结合患者心功能以及不同时间点血清指标临界值对心衰进行预测和诊断，从而可以更精准地诊断心衰[19]。本研究仍存在局限性：纳入病例数偏少；心脏超声检查可以更准确地评价患者的心脏功能，可以考虑在后续研究中将其与血清指标结合对心衰进行联合诊断，可能更有利提高诊断效能。