维生素K2对去卵巢大鼠股骨干骨折愈合及骨密度影响的实验研究

刘烈东，张鹏贵，白晓兵

(1.榆林市第一医院骨科，陕西 榆林 719000；2.榆林市第一医院手足显微外科，陕西 榆林 719000)

骨折是骨科临床上常见疾病之一。随着社会经济及交通运输业的日益发展，各类骨折疾病的发病率正呈逐年上升趋势，已成为严重影响人类生命安全的重要疾病之一[1-2]。骨折患者的恢复周期普遍较长，大部分患者需实施内固定治疗，同时需要借助石膏及夹板外固定辅助治疗，以期实现骨折愈合[3-4]。尽管如此，仍有部分骨折存在延长愈合甚至不愈合情况，从而在一定程度上增加了患者的身心痛苦，对其家庭及社会造成较大的经济负担。因此，通过多种途径促进骨折愈合，减少或避免骨折不愈合、延迟愈合情况的发生，具有极其重要的意义。维生素K2属于天然营养物之一，不少研究[5-6]证实其对骨具有双向调控的作用，目前已成为骨折药物研究热点。然而，关于维生素K2对去卵巢股骨干骨折模型大鼠骨折愈合的影响研究报道并不多见。鉴于此，本研究观察通过维生素K2对去卵巢股骨干骨折模型大鼠骨折愈合及骨密度的影响，为维生素K2应用于股骨骨折治疗中提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雌性SD大鼠90只；周龄11～12周，平均(11.34±0.22)周；体重280～330 g，平均(308.16±8.27)g。所有大鼠均购自四川省中医药科学院实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(川)2013-100。所有大鼠采用统一饲料分笼饲养，自由活动，不限制饮水。随机将其分为假手术组、骨折组及干预组，每组30只。

1.2 主要试剂与仪器 青霉素(批号：23797)购自瑞阳制药有限公司；水合氯醛(批号：30037517)购自国药集团化学试剂有限公司；甲醛溶液(批号：02014)购自恩施州中心医院病理实验室；DAB显色试剂盒、HE染色试剂盒以及BMP-2抗体(批号：21576、21583、20492)均购自武汉博士德生物科技有限公司；酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(批号：EK2118)购自武汉博士德生物科技有限公司；维生素K2(批号：020098)购自上海西宝生物技术有限公司。高速冷冻离心机购自上海安亭科学仪器厂；电子天平购自梅特勒-托利多仪器有限公司；-80 ℃低温冰箱购自山东省青岛市海尔集团电冰箱厂；双能X线骨密度测量仪购自美国Norland-XR36公司；计算机放射成像系统购自日本Konic公司。

1.3 去卵巢股骨干骨折模型制备

1.3.1 去卵巢处理：三组大鼠均实施卵巢切除。按照3 ml/kg的剂量对大鼠腹腔注射10%水合氯醛完成麻醉。选择大鼠背部正中线中下1/3处做长2 cm纵行切口。分别从双侧进行皮下软组织的钝性分离，选择脊柱旁开5 mm处对肌肉组织实施钝性分离，充分暴露卵巢脂肪包被组织。稍稍提起卵巢，选择输卵管卵巢交接部位借助丝线实施结扎。对双侧卵巢进行彻底摘除，逐层缝合。

1.3.2 股骨干骨折模型建立：骨折组与干预组均建立股骨干骨折模型。按照3 ml/kg的剂量对大鼠腹腔注射10 %水合氯醛完成麻醉，常规消毒处理后，选择右大腿中段外侧做长2 cm纵行切口。顺着股外侧肌间隙实施钝性分离直至股骨干，固定股骨并选择股骨干中1/3段借助线锯锯断成横行骨折。随后以直径1.5 mm克氏针逆行插入骨折近端，并自后侧股骨大粗隆穿出，复位骨折后将其顺行插入骨折远端髓腔，剪除多余克氏针。确定骨折固定牢固后，对切口予以生理盐水多次冲洗，采用丝线逐层缝合。碘伏消毒后回笼饲养，术后连续予以青霉素抗感染3 d。

1.4 干预方式 干预组予以维生素K2灌胃，剂量为30 mg/kg，1 次/d。假手术组与骨折组均予以等量0.9%氯化钠溶液干预，所有大鼠均连续干预5周。

1.5 观察指标

1.5.1 骨密度：干预5周后处死大鼠，取右侧股骨进行CR摄片，明确骨痂连续性及骨折愈合情况。随后拔除股骨标本内的克氏针，将股骨按照长度分成三等份，采用双能X线骨密度测量仪测量股骨全长骨密度(tBMD)、中1/3段骨密度(mBMD)和远1/3段骨密度(dBMD)。

1.5.2 骨代谢指标：包括血清骨钙素(BGLAP)、碱性磷酸酶(ALP)以及抗酒石醋酸酸性磷酸酶(TRACP)。采用ELISA法进行检测，具体操作严格遵循试剂盒说明书。

1.5.3 血清血管内皮生长因子(VEGF)：采用真空采血针采集干预5周后的大鼠尾静脉血2 ml，以1500 r/min离心15 min，取上层血清，保存在-80 ℃冰箱中备用。采用ELISA法进行检测，具体操作严格遵循试剂盒说明书。

1.5.4 骨形成蛋白-2(BMP-2)：采集大鼠骨组织标本，进行常规石蜡切片，切片厚度以4 μm为宜，烤片30 min。随后脱蜡、抗原修复，添加封闭液，室温下静置10 min，去除多余水分，以PBS稀释至1∶100，室温条件下孵育60 min。以PBS冲洗2 min，重复3次。采用DAB显色试剂盒显色7 min，再次以水冲洗。采用苏木素复染1 min，1%盐酸酒精分化10 s，水洗3次，梯度脱水，以中性树胶封片，于显微镜下观察骨组织BMP-2表达情况。采用IPP 6.0图像分析软件统计分析。

2 结 果

2.1 三组大鼠术后8周骨折愈合状况 见图1。X线检查发现，骨折组大鼠不完全愈合，即形成较小的骨痂组织，且重建并不完整，尚未发现明显的骨愈合；干预组存在明显的骨痂组织形成、重塑以及骨愈合。

图1 骨折组(左)与干预组(右)大鼠术后8周X线图像

2.2 三组大鼠右股骨骨密度比较 见表1。骨折组大鼠右股骨tBMD、mBMD及dBMD均低于假手术组，而干预组大鼠上述各项指标水平均高于骨折组(均P<0.05)。

表1 三组大鼠右股骨骨密度比较(g/cm2)

2.3 三组大鼠BGLAP、ALP及TRACP水平比较 见表2。骨折组大鼠BGLAP、ALP及TRACP水平均明显高于假手术组，而干预组大鼠上述各项指标水平均明显低于骨折组(均P<0.05)。

表2 三组大鼠BGLAP、ALP以及TRACP水平比较(μg/ml)

2.4 三组大鼠血清VEGF、BMP-2表达水平比较 见表3。骨折组大鼠血清VEGF、BMP-2表达水平均明显低于假手术组，而干预组大鼠VEGF、BMP-2表达水平均高于骨折组(均P<0.05)。

表3 三组大鼠血清VEGF、BMP-2表达水平比较(pg/ml)

3 讨 论

股骨干骨折作为骨科临床常见骨折类型之一，其发病率在全身骨折中占比可达6%，且该比例呈日益增加趋势，已受到国内外广泛关注[7-9]。相关研究[10-12]指出，骨质疏松症主要表现特征为低骨量以及骨组织微细结构破坏，属于股骨干骨折的重要病因之一。尤其是在绝经后的女性中，缺乏雌激素是导致骨质受损的另一重要因素，从而极易引发骨质疏松症的发生，增加了骨折的风险。由此可见，如何有效治疗骨质疏松性骨质对骨科医生而言是一项极大的挑战。骨折后的骨愈合属于修复过程，涉及炎症、成骨、愈伤组织形成以及重塑等，相关动物实验证明卵巢切除动物中的雌激素受体表达失调会对骨愈合产生负面影响，继而引起愈合延迟或不愈合。双侧卵巢切除大鼠普遍存在雌激素衰退，骨转换水平增强，破骨细胞活性提高，促使骨吸收远超骨形成，最终引起骨质量下降，其发病机制与人类绝经后骨质疏松高度一致，是目前临床上应用较为广泛的骨质疏松动物模型。

维生素K具有调节骨代谢及促进骨钙素羧化的作用，且有一定增加骨密度的作用，可降低骨折的发生风险，目前已受到国内外广泛关注[13-14]。本研究发现，维生素K2干预在促进去卵巢股骨干骨折模型大鼠骨折愈合及骨密度改善方面效果明显。考虑原因可能是维生素K2具备抑制白细胞介素-1、白细胞介素-6以及前列腺素等合成的作用，从而有效抑制破骨细胞中的组织蛋白酶K表达，继而起到抑制破骨细胞骨吸收性活性的目的，最终达到促进骨形成的作用。与此同时，骨钙蛋白属于骨组织中含量丰富的一种特异性蛋白，于成骨细胞内合成并通过维生素谷氨酸γ-羧化后分泌至骨基质内，并和基质内的Ⅰ型胶原相结合形成网格支架，进一步为钙盐的沉积提供重要基础，而维生素K2通过对骨钙蛋白的羧化促进骨的矿化成熟[15-16]。

BGLAP可与骨中羟基磷灰石以及钙紧密结合，是目前临床上公认的骨形成标志物，由于其在骨形成过程中介导了成骨细胞的活化，所以可有效反映机体骨丢失率。ALP本质为水解酶，主要作用是从一系列类型的分子中清除磷酸基团，如核苷酸、生物碱以及蛋白质等，其在活跃的骨形成过程中异常增加。TRACP则是一种糖基化单体金属蛋白酶，也是一种骨吸收标志物，可在磷酸化状态下和破骨细胞相结合，促进骨桥蛋白去磷酸化，同时促使破骨细胞迁移并出现再吸收。本研究发现，维生素K2干预可明显改善去卵巢股骨干骨折模型大鼠BGLAP、ALP以及TRACP水平。其原因可能是维生素K2具有激活异质物(SXR)受体作用，同时可有效调控成骨细胞的骨标志物基因表达促进骨形成。研究[17-18]表明，维生素K2可通过SXR影响TSK基因的表达，继而刺激细胞外基质胶原发生聚集，为骨形成创造有利条件。

VEGF属于二聚体糖蛋白，参与骨折修复的整个过程。既往相关研究[19-20]表明，VEGF在骨折断端可发挥促进血管内皮细胞分裂、再生的作用，进一步通过多种途径和血管内皮细胞特异性结合，为骨折断端的特异性环境提供骨生长因子所需的相关代谢物质，从而改善骨再生的微环境。BMP是一种糖蛋白，属于转化生长因子家族成员，可在早期刺激骨间充质干细胞朝成骨细胞方向分化、增殖，并会促进其他家族因子朝成骨细胞方向增殖，共同促进骨组织的成熟[21-22]。本研究发现，维生素K2可有效上调血清VEGF、BMP-2表达水平，这可能是维生素K2促进骨折愈合的重要机制之一。

综上所述，维生素K2可促进去卵巢股骨干骨折模型大鼠的骨折愈合并增加骨密度。