NLRP3 炎症小体在A 型主动脉夹层形成中的作用机制探讨

门 琛，邵永丰，马路遥，黄浩斌，郑翔翔（通讯作者）

（1 南京医科大学第一附属医院老年科 江苏 南京 210029）

（2 南京医科大学第一附属医院心脏大血管外科 江苏 南京 210029）

主动脉夹层（aortic dissection, AD）是主动脉疾病中最严重的一种临床疾病，起病急、发展快、病情复杂、病死率和误诊率高。据主动脉夹层国际登记组织（International Registry of Acute Aortic Dissections,IRAD）分析，推算出男性发病率为16/10 万，女性发病率为9.1/10 万[1]。AD 的发病特点在于中膜病变，内膜撕裂而造成血液经撕裂口进入动脉壁中形成夹层。根据Stanford 夹层分型，A 型主动脉夹层（type A aortic dissection, AAD）累及升主动脉，也可累及主动脉弓、胸降主动脉和腹主动脉；Stanford B 型夹层累及胸降主动脉，可同时累及腹主动脉[2]。其中以AAD 最为危险，外科手术是其主要救治方法，但手术风险高，手术花费巨大。因此，如何预防AD 的发生发展，降低其病死率仍然是当前临床医疗急需解决的问题。近年来不断有研究证实了炎症反应在主动脉壁重塑及夹层形成过程中起重要作用[3]。炎症小体（Inflammasome）是一种调控IL-1β产生的大分子多蛋白复合体，NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosisassociated speck-like protein containing a CARD, ASC）和前体蛋白pro-Caspase-1 参与了NLRP3炎症小体的组成。炎症小体在自身免疫性疾病及血管粥样硬化中的重要性已被充分证明[4]，但在主动脉瘤及主动脉夹层形成机制中研究较少。本研究旨在明确NLRP3炎症小体在AAD 中的表达，探讨其介导的炎症反应在AAD 发生发展中的作用机制。

1.资料与方法

1.1 一般资料

选取2020 年1 月—2021 年1 月南京医科大学第一附属医院心脏大血管外科收治的A 型主动脉夹层急诊行升孙氏手术（升主动脉置换+主动脉弓替换+象鼻支架植入）的患者作为实验组。对照组为同期在我在院行心脏移植的供体。两组在年龄方面进行匹配，每组各15 例。两组患者一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。排除标准：①发病至急诊手术时间超过24 h；②患者有自身免疫性疾病、结缔组织病或长期服用激素；③某些遗传性疾病，如马凡综合征、先天性二叶式主动脉瓣；④慢性肝肾功能不全。本研究经南京医科大学第一附属医院伦理委员会批准（伦理审批号：2020-SR-450），所有患者在入组前均签署知情同意书。

表1 两组临床资料比较

1.2 组织标本收集

AAD 组选取在升主动脉夹层破口附近的主动脉壁组织。主动脉壁组织离体后立即剔除外周脂肪及血栓，并用0.9%氯化钠溶液冲洗，一部分组织-80 ℃液氮保存，另一部分组织甲醛固定。对照组为在本中心行心脏移植，供心移植前修剪弃用的升主动脉壁组织，保存方式和AAD 组相同。

Western blotting。将主动脉组织剪碎，将其加入RIFA 裂解缓冲液取上清液。使用二喹啉甲酸（BCA）蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，上清液置于-70 ℃冰箱保存。将蛋白样品与上样缓冲液混合，加热后再取上清加样后进行蛋白电泳。利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离总蛋白，并转至聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜）。分别加NLRP3、ASC、caspase-1、炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的特异性一抗4 ℃孵育过夜。经TBST 洗涤3 遍后，再与辣根过氧化物酶标记的相应二抗室温反应，ECL 化学发光显色。由自动曝光仪曝光拍照，用Image J 软件（National Institutes of Health）对目标蛋白条带进行分析。

1.3 免疫组化

免疫组化检测主动脉壁样品中CD68 细胞（巨噬细胞）。制备福尔马林固定和石蜡包埋的切片，并与CD68（Abcam, Cambridge, MA, USA）的一抗在4 ℃下温育过夜，然后用二氨基联苯胺染色，苏木精复染。用盖玻片安装切片并在光学显微镜下检查。用Olympus 显微镜对切片进行观察、拍照。高倍镜（×400）下观察切片标本，应用图像分析系统（Image-Pro plus, version 6.0, Media Cybernetics）测定阳性信号平均光密度值（IOD/area）作为阳性染色的表达量。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计软件进行数据处理。正态分布的计量资料采用均数±标准差（± s）表示，组间比较采用t检验，计数资料用频数和百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 两组患者主动脉壁炎症小体及相关炎症因子表达水平比较

AAD 组患者主动脉壁中炎性小体的组成成分，即NLRP3、ASC 和caspase-1 的蛋白水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。AAD 组主动脉壁中炎性细胞因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 蛋白水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组升主动脉壁组织中炎性小体及炎症因子表达水平比较（± s）

表2 两组升主动脉壁组织中炎性小体及炎症因子表达水平比较（± s）

AAD 组对照组tP NLRP3140.5±12.1109.6±9.77.780.035 ASC243.4±14.690.7±4.233.100.012 caspase-1167.7±21.1 103.2±12.210.240.029 IL-1β140.2±17.6119.3±5.63.590.042 IL-6155.0±23.6111.3±4.15.950.034 TNF-α132.5±11.498.5±9.47.430.031

2.2 两组患者主动脉壁CD68 表达水平比较

AAD 组患者升主动脉组织中CD68（5.31±0.51），免疫组化定量分析其表达量高于对照组的（1.23±0.11），差异有统计学意义（P= 0.006），即AAD 患者升主动脉壁的炎性表达较对照组更加明显，炎症反应在AAD 患者主动脉血管平滑肌组织上有明显的表现。见图1。

图1 主动脉平滑肌组织中CD68 分布（×400）深色为CD68 分布的区域

3.讨论

动物及人体研究均发现，主动脉夹层发生时血管局部炎症反应增强，表现为大量单核巨噬细胞、多核白细胞及T/B 淋巴细胞浸润，血管平滑肌细胞（vascularsmooth musclecells, VSMC）凋亡相关miRNAs 表达增多，炎症相关miRNAs 水平显著增加[5-6]。本文结果观察到AAD 患者的主动脉平滑肌组织中性粒细胞及单核细胞浸润均较对照组显著升高，炎性细胞标记物CD68 的表达量也明显增加。本实验发现AAD 患者主动脉平滑肌中炎性小体组成蛋白NLRP3、ASC、caspase-1 的水平明显升高，其下游炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的蛋白水平也显著升高。这些结果表明NLRP3 炎症小体活化，下游炎性细胞因子释放增加介导了主动脉血管平滑肌的炎症反应，最终导致了AAD 的形成。因此我们推测炎症小体在这种炎症介质反应的主动脉平滑肌细胞中的表达上调可能是导致AAD 炎症机制的一个重要调控点。

综上所述，炎症小体可作为探索A A D 中导致血管平滑肌细胞增殖和迁移，主动脉血管重塑的信号传导和功能机制研究的新靶点，并且可以作为预测主动脉夹层病变发展的新型生物标志物和药物治疗A A D 的新靶点。