穿心莲内酯对溃疡性结肠炎患者外周血单个核细胞IL-23/IL-17轴的影响

朱 琴 束 龙 冯玉良 郑培奋

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性、非特异性肠道炎性疾病。据报道，近年来在我国的发生率呈明显的上升趋势，其好发于青壮年，病程迁延、易复发，给家庭、社会带来巨大的负担[1]。目前UC治疗的主要药物仍存在不良反应多、耐药、及价格昂贵的缺点。

UC的发病机制目前尚不明确，但普遍认为与遗传易感宿主对肠道菌群的免疫应答失常有关。目前研究表明，IL-23/IL-17轴在UC的发病机制中可能处于重要地位。肠道炎症时，肠道细菌抗原可刺激肠道内专职抗原递呈细胞，促使其分泌IL-23等前炎性细胞因子，初始CD4+T细胞在其作用下，经STAT3通路激活控制辅助性T细胞17分化的关键转录因子——视黄酸相关孤核受体(ROR-γt)，促进T细胞分化为Th17细胞，并诱导编码IL-17基因表达，使Th17细胞特征性分泌IL-17。IL-17具有强大的募集和激活嗜中性粒细胞的能力，刺激成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞和上皮细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6等多种促炎性细胞因子。在正常肠道环境中，Th17细胞的主要作用可能是保护性的，而在UC的发病机制中，高表达的IL-23激活了IL-17的致病性，造成肠道严重的组织损伤[2,3]。

穿心莲内酯是穿心莲的提取物及主要有效成分，分子式为C20H30O5。笔者进行的前期动物实验发现，穿心莲内酯能够抑制IL-23/IL-17轴，降低TNBS结肠炎小鼠疾病活动指数评分，促进肠道黏膜修复[4]。然而穿心莲内酯对UC患者IL-23/IL-17轴的影响尚未完全阐明。本研究利用UC患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，通过体外细胞实验，探讨穿心莲内酯对IL-23/IL-17轴的调控作用及治疗UC的作用机制，为探索UC治疗的新策略提供线索和理论依据。

对象与方法

1.主要试剂：穿心莲内酯(andrographolide，AG)购自美国Sigma-Aldrich公司；人淋巴细胞分离液购自加拿大Cedarlane公司；RPMI-1640 购自美国HyClone公司；人IL-23酶联免疫分析试剂盒、人IL-17A酶联免疫分析试剂盒购自中国Bioswap公司；anti-CD4-FITC、anti-IL-17-PE购自美国BioLegend公司；ROR-γt抗体购自英国Abcam公司；抗GAPDH购自美国Cell Signaling Technology公司；HRP标记抗体购自碧云天生物技术有限公司；流式细胞仪(Accuri C6)购自美国Bio-Rad Laboratories公司。

2.研究对象：获取知情同意后，30例来自浙江医院消化内科的UC患者进入了研究。所有UC的诊断均根据临床特征、结肠镜、影像学、手术及病理的结果，符合2012年中华医学会消化病学分会制定的诊断标准。所有受试者均采集静脉血样本20ml。本研究方案通过浙江医院医学伦理学委员会审核批准[2015(10K)号]，入组患者均签署了知情同意书。

3.外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)获取：将2ml新鲜血样本转入10ml无菌离心管中，加入2ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；加入4ml人淋巴细胞分离溶液。然后将稀释的血液4ml轻轻加到离心管的淋巴细胞分离液上层；2000r/min离心20min，PBMC所在细胞层为白色。用移液器将该层细胞吸取在另一干净无菌的10ml离心管中。1500r/min，10min离心后去掉上清，再加入PBS至5ml，进行相同操作的清洗3次；加入1ml RMPI-1640完全培养基重悬细胞，即得单核细胞悬液。

4.细胞培养及分组处理：PBMCs细胞采用含10%胎牛血清，1%双抗(青链霉素混合液)的RMPI-1640培养液，置于37℃，5% CO2的培养箱中进行培养。显微镜下观察其为悬浮细胞，台盼蓝染色活细胞率达95%以上。PBMCs细胞按照每孔100万的密度铺入12孔板中。将提取的每份PBMCs细胞再分成4份，分别处理。其中空白对照组：PBMC细胞加入DMSO培养； 低浓度穿心莲内酯(10μg/mlAG)组、中浓度穿心莲内酯(20μg/mlAG)组、高浓度穿心莲内酯(30μg/mlAG)组分别加入相应浓度的穿心莲内酯处理48h。处理后的PBMCs细胞分别进行ELISA、流式细胞检测及Western blot法检测。

5.ELISA法检测细胞培养液中IL-23和IL-17A浓度：应用双抗体夹心法测定细胞培养液中IL-23和IL-17A浓度。用纯化的人IL-23和IL-17A抗体分别包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中分别依次加入IL-23和IL-17A，再与 HRP 标记的IL-23和IL-17A抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化呈蓝色，并在酸的作用下转化呈最终的黄色。颜色的深浅和样品中的IL-23和IL-17A呈正相关。用酶标仪在 450nm波长下测定吸光度(A)值，通过标准曲线计算样品中IL-23和IL-17A浓度。

6.流式细胞法检测Th17(CD4+IL-17+)细胞亚群占CD4+T细胞比例：将单核细胞悬液进行细胞计数；以1000r/min离心10min，弃上清，沉淀用RMPI-1640培养基重悬；用RMPI-1640培养基调整待检测细胞浓度为0.5×105个/毫升，接种于24孔板中，加入佛波醇乙酯(PMA)100ng/ml，离子霉素1μg/ml和蛋白质转运抑制剂莫能菌素1μg/ml，之后放入37℃ 5%CO2的细胞培养箱中培养4h；用anti-CD4-FITC标记4℃ 1h；孵育结束后，预冷PBS洗涤两次后加500μl 4%多聚甲醛PBS溶液固定，避光放置20min，300×g，离心5min，沉淀细胞用0.1%PBS-Triton溶液破膜，避光放置10min，离心弃上清。用anti-IL-17-PE进行标记。流式细胞仪检测各细胞亚群比例。CD4+IL-17+为Th17细胞。

7.Western blot法检测Th17细胞相关转录因子ROR-γt表达水平：将培养的PBMC细胞从培养箱中取出，吸去培养液，适量预冷的1×PBS洗涤2次，吸去PBS，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液，4℃充分裂解细胞，将细胞刮入1.5ml EP管中，95℃以上加热10min，12000×g离心10min，取上清，进行蛋白质定量后贮存于-80℃冰箱。BCA法蛋白定量。SDS-PAGE电泳：取蛋白上样量80μg，再加1/4总体积的蛋白上样缓冲液，最后用RIPA补齐至总体积相等(20μl)，混匀后沸水煮5min。上样，接通电源，80V电泳至分离胶120V电泳。半干式转膜25V转膜30min。封闭：5%脱脂奶粉室温封闭1h或4℃过夜。一抗：ROR-γt 1∶1500，GAPDH1∶2000稀释抗体，抗体加入封闭液中稀释到所需浓度，室温孵育2h或4 ℃孵育过夜。二抗：孵育一抗的膜用TBST洗涤3次，每次5min。随后根据用量，按照1∶1000稀释HRP标记的二抗，37℃孵育1h。用TBST洗涤3次，每次5min。ECL化学发光检测。

结 果

通过检测比较UC空白对照组与低、中、高浓度穿心莲内酯组IL-23浓度、Th17细胞相关转录因子ROR-γt表达水平、Th17细胞亚群的比例及下游促炎性细胞因子IL-17A水平，研究穿心莲内酯对UC患者PBMCs IL-23/IL-17轴的调控作用。

1.穿心莲内酯(AG)对UC患者PBMCs分泌IL-23和IL-17A的作用：ELISA检测空白对照组、低浓度穿心莲内酯(10μg/mlAG)组、中浓度穿心莲内酯(20μg/mlAG)组、高浓度穿心莲内酯(30μg/mlAG)组细胞培养液中IL-23和IL-17A浓度。与空白对照组比较，低、中、高浓度穿心莲内酯组的IL-23和IL-17A浓度均明显下降(P=0.000),且呈穿心莲内酯剂量依赖效应(表1、图1)。

表1 各组UC患者细胞培养液中IL-23和IL-17A浓度

图1 穿心莲内酯(AG)对UC患者PBMCs分泌IL-23和IL-17A的作用A.空白对照组与低、中、高浓度穿心莲内酯组IL-23浓度比较;B.空白对照组与低、中、高浓度穿心莲内酯组IL-17A浓度比较。与空白对照组比较，*P=0.000；与低浓度穿心莲内酯组比较，#P=0.000；与中浓度穿心莲内酯组比较，ΔP=0.000

2.穿心莲内酯对UC患者Th17细胞亚群/CD4+T细胞比例的作用：空白对照组Th17(CD4+IL-17+)细胞亚群占CD4+T细胞比例为16.17%±0.45%。与空白对照组比较，低浓度穿心莲内酯组(10.13%±0.37%)、中浓度穿心莲内酯组(7.22%±0.67%)、高浓度穿心莲内酯组(4.51%±0.18%)的Th17(CD4+IL-17+)细胞亚群占CD4+T细胞比例均降低，差异均有统计学意义(F=382.832，P均为0.000)，且不同浓度穿心莲内酯组间呈剂量依赖效应(P=0.000)，详见图2。

图2 穿心莲内酯对UC患者Th17细胞亚群/CD4+T细胞比例的作用A.流式细胞法检测结果;B.各组PBMCs中Th17(CD4+IL-17+)细胞亚群占CD4+T细胞比例。Th17细胞(CD4+IL-17A+细胞)：右上象限，CD4+T 细胞：右上及右下象限。与空白对照组比较，*P=0.000；与低浓度穿心莲内酯组比较，#P=0.000；与中浓度穿心莲内酯组比较，ΔP=0.000

3.穿心莲内酯对UC患者PBMCs中Th17细胞相关转录因子ROR-γt表达水平的作用：与空白对照组比较，低、中、高浓度穿心莲内酯组ROR-γt表达水平显著降低(P=0.000)；不同浓度穿心莲内酯组ROR-γt表达水平呈剂量依赖效应(P=0.000)，详见表2、图3。

表2 各组UC患者PBMCs中Th17细胞相关转录因子ROR-γt表达水平

图3 穿心莲内酯对UC患者PBMCs中ROR-γt水平的作用A.Western blot法检测结果图；B.各组ROR-γt/GADPH比例。与空白对照组比较，*P=0.000；与低浓度穿心莲内酯组比较，#P<0.05；与中浓度穿心莲内酯组比较，ΔP<0.05

讨 论

溃疡性结肠炎的病因和发病机制尚未完全阐明，但免疫应答失常在UC发病中十分关键。目前已证实，促炎性细胞因子包括肿瘤坏死因子TNF-α、IL-1β和IL-6等与UC的发病密切相关[5]。IL-23/IL-17轴已报道可调节促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6，因此在UC的发病中可能起关键作用[3,6]。有研究证明，UC患者肠道黏膜中IL-23R、IL-17的mRNA表达增加，并且与UC患者疾病活动度评分呈正相关[7]。Zhang等[8]研究发现，IL-17R敲除或IL-17R IgG处理后的小鼠与野生型小鼠比较，对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)引起的结肠炎有更强的抵抗力。Elson等[9]研究发现，抗IL-23亚基p19的抗体可降低肠道中促炎性细胞因子的表达，从而导致Th17细胞凋亡并抑制肠道炎症。这些研究均表明了IL-23/IL-17轴在UC发病中的重要作用。

目前临床治疗UC的药物主要包括5-氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂和单克隆抗体等，但存在不同程度的不良反应(如骨髓肝脏毒性、增加感染风险)及耐药性等问题，且价格昂贵，给患者家庭及我国医保系统带来较大经济负担[10,11]。因此，研发具有自主知识产权的抗UC药物，具有重要的临床及经济价值。

穿心莲属爵床科植物，临床常用于治疗肠道腹泻及呼吸道感染性疾病，其中药汤剂在UC的临床治疗中也取得了良好疗效。穿心莲内酯是穿心莲的主要有效成分。目前穿心莲内酯治疗脓毒血症、脑膜炎、急性肺损伤等的研究结果提示其具有良好的抗氧化及抗炎作用[12～16]。本课题组一直致力于UC发病机制及治疗方面的研究，前期动物实验中，笔者所在团队利用TNBS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型，研究结果显示，穿心莲内酯能下调IL-23/IL-17轴，抑制IL-17及TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎性细胞因子水平(P=0.000)，并有效地改善结肠炎小鼠的结肠黏膜大体形态及组织病理学评分(P<0.05)[4]。表明穿心莲内酯可以抑制肠道炎症，促进肠道黏膜修复。

本研究进一步利用UC患者外周血单个核细胞，分别予低浓度穿心莲内酯(10μg/mlAG)、中浓度穿心莲内酯(20μg/mlAG)、高浓度穿心莲内酯(30μg/mlAG)处理。研究结果发现，与空白对照组比较，低、中、高浓度穿心莲内酯均能降低UC患者IL-23水平(P=0.000)，降低Th17细胞亚群的比例(P=0.000)、Th17细胞相关转录因子ROR-γt表达水平(P=0.000)及相关促炎性细胞因子IL-17A水平(P=0.000)，并且呈剂量依赖效应。

综上所述，本研究结果显示，穿心莲内酯对IL-23/IL-17轴有抑制作用，可能通过下调IL-23/IL-17轴，起到抑制UC炎性反应的作用。研究结果为探索UC治疗的新策略及穿心莲内酯治疗UC的临床应用提供科学依据。