酵素产品中游离氨基酸定量分析方法的研究

雷 超，刘锋军，徐飞燕

（1.渭南市检验检测研究院，陕西渭南 714000；2.陕西省发酵产品质量监督检验中心，陕西渭南 714000）

氨基酸是含有氨基和羟基的一类有机化合物，是组成蛋白质的基本单位[1]，对发酵产品而言，也是重要的风味物质[2-3]，其含量的高低直接影响产品的口感和营养价值，在现有的酵素相关标准中，也明确规定了游离氨基酸的质量指标[4-5]。本文通过采用不同前处理方法，对不同酵素样品中游离氨基酸检测方法进行比较分析，筛选出一种操作简便，准确可靠的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氨基酸混合标准溶液、茚三酮试剂套装（Sykam公司）；甲醇、无水乙醇（色谱纯，天津科密欧），其他试剂均为分析纯；超滤离心装置（截留分子量MWCO 10 000）；测试样品为1#桑葚酵素原液，2#果蔬汁复合酵素，3#富平柿子酵素。

1.2 仪器与设备

S-433D全自动氨基酸分析仪（Sykam公司）；BT-224S电子天平（赛多利斯）；冷冻离心机（上海安亭）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理

称取0.5～2.0 g（精确至1 mg）混匀试样，置于10.0 mL容量瓶中备用。按以下3种方法提取净化。

方法A磺基水杨酸净化法：加入2%（m/m）磺基水杨酸溶液溶解并定容至刻度，混匀后全部转移至50 mL离心管中，涡旋振荡1 min后静置1 h，10 000 r/min离心15 min，取上清液过0.22 μm滤膜后上机分析。

方法B乙醇溶液净化法：加入85%（v/v）乙醇溶液溶解并定容至刻度，混匀后全部转移至50 mL离心管中，涡旋振荡1 min后静置1 h，10 000 r/min离心15 min，准确吸取上清液2.0 mL于表面皿中，40 ℃水浴蒸干。准确加入 2.0 mL样品稀释液溶解，过0.22 μm滤膜后上机分析。

方法C离心式超滤净化法：加入超纯水溶解并定容至刻度，超声提取15 min，待溶液冷却后吸取4mL样液，通过0.22 μm滤膜后注入超滤离心管中，12 000 r/min离心 20 min，吸取超滤液2.0 mL于表面皿中，接下来同方法B。

1.3.2 仪器分析条件

色谱柱LCAK06/Na型；柱温箱程序升温，升温程序为初始57 ℃保持22 min，然后以3.4 ℃/min升温至74 ℃保持21 min，最后以3.4 ℃/min降温至57 ℃并保持5 min；衍生泵流速0.25 mL/min；反应器温度130 ℃；检测波长570 nm和440 nm；LC梯度洗脱由A、B、C、D 4个泵按比例完成，A泵为pH=3.45柠檬酸钠缓冲溶液，B泵为pH=10.85柠檬酸钠缓冲溶液，C泵为5%（v/v）甲醇水溶液，D泵为再生液（20.0 g/L氢氧化钠标准溶液），4个泵梯度比例为：0～11.0 min A泵100%，11.1～17.0 min A泵85%、 B泵15%，17.1～27.0 min A泵67%、B泵33%，27.1～30.0 min A泵20%、B泵80%，30.1～42.0 min B泵100%，42.1～45.1 min D泵100%，45.2～58.3 min A泵100%；洗脱泵流速0.45 mL/min；进样量50 μL。

2 结果与讨论

2.1 方法检出限

取100 nmol/mL标准工作溶液重复7次测定，17种氨基酸标准在43 min内能全部分离，且分离度较高，峰型较好（见图1）。逐步稀释混合标准溶液，直至信噪比小于3。当取样量为2 g时，该方法测定17种氨基酸的检出限（3倍信噪比）在0.154～2.09 μg/100 g，定量限（10倍信噪比）在0.512～6.980 μg/100g，表明该仪器方法完全能够满足要求。

图1 17种氨基酸标准色谱图

2.2 准确度和精密度

按照前述方法分别做不同样品的加标回收试验，氨基酸混合标准溶液加标量100 μL（0.563 6 mg），同时测定其本底值，以氨基酸总量计算加标回收率，并计算多次的RSD值，结果见表1。

由表1可知，选取3个代表性样品，采用A、B、C 3种前处理方法对样品中游离氨基酸进行提取净化，在给定的仪器条件下，上机测定17种游离氨基酸的总含量，平行测定3次，结果取平均值。结果表明，3种不同方法对于同一酵素样品中游离氨基酸的检测结果有一定差别，方法A检测结果最高，且偏差较小；方法B检测结果最低，偏差较大；方法C检测结果仅次于方法A，因此从检测结果上可以得出方法A的精确性更好。以方法A测定结果为例，3个酵素样品均检出17种游离氨基酸，其游离氨基酸总含量为：1#样品0.257 g/100 g，含量较高；3#样品 0.064 5 g/100 g，含量次之；2#样品0.054 3 g/100 g，含量较低。经实际检测表明以桑葚、富平柿子等为主要原料，经发酵工艺生产的酵素产品中游离氨基酸种类分布全面，含量 较高。

表1 3种不同前处理方法加标回收试验结果及标准偏差表

3 结论

方法A平均加标回收率101.5%，RSD为0.70%，具有良好的准确度和精密度，适用于酵素样品中游离氨基酸的快速准确定量分析；方法C具有无污染、环保等优势，但单个样品检测成本较高；方法B乙醇溶液能和氨基酸上的羧基发生酯化反应生成水，使得其准确度和精密度较差，因此不适用于酵素产品中游离氨基酸的检测。