JAK2/STAT3通路槲皮素对先兆流产大鼠的保胎作用及对激素水平的影响

张 堃，吕向坤，焦艾丽，丁雪蕾

先兆流产指妊娠28周期间出现的阴道流血、下腹痛或腰痛等症状，盆腔检查宫口未开、胎膜完整、无妊娠物排出，若未及时治疗，症状加重，可能发展为“难免流产”，甚至威胁到母亲和胎儿的生命安全，是孕早期常见的并发症，中医学中“胎漏”“胎动不安”“滑胎”等属于西医先兆流产的范畴[1]。中医治疗先兆流产以安胎为主，固肾、养血、扶脾、益气是基本治疗方法[2]。槲皮素是一种天然植物源黄酮类化合物，是中药桑寄生、菟丝子和杜仲等的主要成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒，抑制脂质过氧化、血小板聚集及心脏保护等多种药理作用[3，4]。桑寄生、菟丝子等作为保胎中药复方中的君药发挥作用，槲皮素作为其主要活性成分能否改善妊娠结局逐渐受到关注[5]。本研究拟通过建立先兆流产大鼠模型，探讨槲皮素对先兆流产大鼠的保胎作用和对激素水平的影响及可能作用机制，为槲皮素相关药物的研发和先兆流产的临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级SD雌性未育大鼠55只，雄性大鼠25只(8周龄，体质量雌性200～240 g，雄性280～300 g)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0011。饲养环境：IVC独立送风隔离笼雌雄分笼饲养，温度20～25 ℃，相对湿度55%～65%，光照周期12 h，根据国家实验动物管理条例进行喂养。本研究经我院伦理委员会审核批准。

1.1.2 药品、主要试剂和仪器 槲皮素(纯度98%)购自美国Sigma公司；α-氰基-(3，4-羟基)N-苄苯乙烯胺(AG490)购自美国Sigma公司；干扰素γ(interferon-γ，IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素10(interleukin-10，IL-10)、雌二醇、孕激素ELISA试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司；β-人绒毛膜促性腺激素(β-human chorionic gonadotropin，β-HCG)ELISA试剂盒购自南京生兴生物技术有限公司；兔抗鼠Janus激酶2(Janus kinase2，JAK2)一抗、p-JAK2一抗、信号传导及转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription3，STAT3)一抗、p-STAT3一抗购自美国Thermo Fisher Scientific公司；兔抗鼠β-actin一抗购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔二抗购自英国Abcam公司；酶标仪购自美国Molecular Device公司；蛋白凝胶电泳仪购自上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 造模、分组及药物干预 55只SD雌性大鼠灌胃2 mg/kg己烯雌酚一次促情以增加交配率，次日做阴道涂片检查，根据动情期雌鼠阴道细胞变化特征选择合格动情雌鼠，与雄鼠按2∶1比例合笼过夜交配，次晨制作阴道涂片观察精子，发现大量精子为妊娠1 d。取50只妊娠大鼠按照随机数字表法分为正常组、模型组、槲皮素组、AG490组、槲皮素+AG490组，每组10只。妊娠第1 天开始，槲皮素组、AG490组分别灌胃2.5 mg/ml槲皮素(生理盐水配制)、3 mg/kg AG490(生理盐水配制)，1次/d，连续7 d；槲皮素+AG490组先后灌胃2.5 mg/ml槲皮素和3 mg/kg AG490，1次/d，连续7 d；正常组、模型组实验期间灌胃等量生理盐水。除正常组外其余各组于妊娠8 d上午8时灌胃8.3 mg/kg米非司酮，下午6时灌胃100 μg/kg米索前列醇引发流产；正常组灌胃等量生理盐水。妊娠9 d，槲皮素组、AG490组和槲皮素+AG490组分别给予2.5 mg/ml槲皮素、3 mg/kg AG490和2.5 mg/ml槲皮素+3 mg/kg AG490继续灌胃4 d。

1.2.2 标本采集与处理 各组大鼠妊娠2周后称体质量，眼眶采血，3000 r/min(离心半径8 cm)离心10 min，取上清置于-20 ℃冰箱备用。颈椎脱臼法处死大鼠，无菌解剖迅速摘取双侧卵巢和子宫，取出胚胎后称重。部分子宫用Bouin液固定，后续进行HE染色，部分子宫用液氮快速冷冻，后续进行Western Bloting实验。

1.2.3 ELISA检测大鼠血清激素水平及免疫因子含量 酶标板设空白孔、标准品孔和样品孔，标准品孔加梯度稀释的不同浓度标准品，样品孔加样品稀释液与样品，混匀后封板，37 ℃孵育30 min，清洗液洗涤后拍干，除空白孔外其余各孔加50 μL酶标试剂，封板后37 ℃孵育1 h，洗涤后拍干，每孔加入100 μl显色液，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色20 min，标准品孔出现颜色梯度变化时，加终止液终止反应，以空白孔调零，450 nm波长测吸光度(OD)值，使用CurveExpert软件以标准品浓度与OD值为变量绘制标准曲线，计算大鼠血清雌二醇、β-HCG和孕激素及免疫因子IFN-γ、TNF-α和IL-10的浓度。

1.2.4 检测流产率和胚胎吸收率 观察各组大鼠胚胎情况，发生死亡(吸收)胚胎的大鼠解剖时子宫呈现“竹节状”，胚胎个体小，颜色呈黑褐色且部分出血坏死，没有胎膜结构。正常妊娠大鼠子宫内未见瘀血，胚胎个体较大，颜色淡红，胎膜完整且胎鼠轮廓清晰。按照下列公式计算雌鼠流产率和胚胎吸收率：流产率(%)=流产的雌鼠数/实验组雌鼠总数×100%；胚胎吸收率(%)=被吸收的胚胎数/(被吸收的胚胎数+正常胚胎数)×100%。

1.2.5 计算脏器系数 按照以下公式计算各组大鼠脏器系数：脏器系数=[子宫质量(mg)+卵巢质量(mg)]/体质量(g)×10。

1.2.6 HE染色观察大鼠子宫组织形态学变化 固定好的子宫组织脱水后石蜡包埋，切片(厚度4 μm)，二甲苯脱蜡，水化，苏木精、伊红染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜观察各组大鼠子宫组织形态学变化。

1.2.7 Western Blot检测JAK2/STAT3通路相关蛋白的表达 取100 mg子宫组织，研磨后提取总蛋白，BCA法测样品浓度，蛋白变性后上样至10%SDS-PAGE电泳，转膜仪将蛋白转移至NC膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，分别用JAK2(1∶500)、p-JAK2(1∶200)、STAT3(1∶500)、p-STAT3(1∶200)、β-actin(1∶1000)一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜10 min×3次，再用HRP标记二抗(1∶2000)室温孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL化学发光液于暗室曝光显影，对感光胶片条带进行灰度分析，以目的蛋白条带灰度值/内参β-actin蛋白条带灰度值的比值，作为目的蛋白相对表达水平。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清激素水平 大鼠血清雌二醇、β-HCG和孕激素水平组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与正常组比较，模型组血清雌二醇、β-HCG和孕激素水平降低(P<0.05)；与模型组比较，槲皮素组血清雌二醇、β-HCG和孕激素水平升高，AG490组血清雌二醇、β-HCG和孕激素水平降低(P<0.05)；与槲皮素组比较，槲皮素+AG490组血清雌二醇、β-HCG和孕激素水平降低(P<0.05)；与AG490组比较，槲皮素+AG490组血清血清雌二醇、β-HCG和孕激素水平升高，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 各组受孕大鼠血清雌二醇、β-HCG和孕激素水平比较

2.2 各组大鼠血清免疫因子含量 大鼠血清IFN-γ、TNF-α和IL-10水平组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与正常组比较，模型组血清IFN-γ、TNF-α水平升高，IL-10水平降低(P<0.05)；与模型组比较，槲皮素组血清IFN-γ、TNF-α水平降低，IL-10水平升高，AG490组血清IFN-γ、TNF-α水平升高，IL-10水平降低(P<0.05)；与槲皮素组比较，槲皮素+AG490组血清IFN-γ、TNF-α水平升高，IL-10水平降低(P<0.05)；与AG490组比较，槲皮素+AG490组血清IFN-γ、TNF-α水平降低，IL-10水平升高(P<0.05，表2)。

表2 各组大鼠血清IFN-γ、TNF-α和IL-10水平比较

2.3 各组大鼠流产率和胚胎吸收率 大鼠流产率、胚胎吸收率组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与正常组比较，模型组流产率、胚胎吸收率升高(P<0.05)；与模型组比较，槲皮素组流产率、胚胎吸收率降低(P<0.05)；与槲皮素组比较，AG490组流产率、胚胎吸收率升高，槲皮素+AG490组胚胎吸收率升高(P<0.05)；与AG490组比较，槲皮素+AG490组胚胎吸收率降低(P<0.05，表3)。

表3 各组大鼠流产率和胚胎吸收率 (n=10；%)

2.4 各组大鼠脏器系数 大鼠子宫、卵巢合重和脏器系数组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与正常组比较，模型组大鼠子宫、卵巢合重减小，脏器系数降低(P<0.05)；与模型组比较，槲皮素组大鼠子宫、卵巢合重增加，脏器系数升高，AG490组大鼠子宫、卵巢合重减小，脏器系数降低(P<0.05)；与槲皮素组比较，槲皮素+AG490组子宫、卵巢合重减小，脏器系数降低(P<0.05)；与AG490组比较，槲皮素+AG490组子宫、卵巢合重增加，脏器系数升高(P<0.05，表4)。

表4 各组大鼠脏器系数比较

2.5 各组大鼠子宫组织形态学变化 HE染色结果显示，正常组妊娠大鼠子宫内膜较厚，结节状膨大，腺体、血管丰富，肌层正常；模型组子宫内膜变薄，多数结节无膨大，腺体萎缩，似未孕大鼠子宫；槲皮素组子宫内膜增厚，结节状膨大，腺体数量增加，腺体萎缩明显好转；AG490组子宫内膜较模型组变薄，无结节状膨大，腺体数量减少，萎缩严重；槲皮素+AG490组子宫组织较AG490组子宫内膜增厚，有结节状膨大，腺体数量增加、萎缩减轻(图1)。

图1 各组大鼠子宫组织病理变化(HE，×200)A.正常组；B.模型组；C.槲皮素组；D.AG490组；E.槲皮素+AG490组

2.6 各组大鼠JAK2/STAT3通路相关蛋白表达水平 大鼠子宫组织p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与正常组比较，模型组p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量降低(P<0.05)；与模型组比较，槲皮素组p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量升高，AG490组p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量降低(P<0.05)；与槲皮素组比较，槲皮素+AG490组p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量降低(P<0.05)；与AG490组比较，槲皮素+AG490组血清p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量升高(P<0.05)。各组大鼠子宫组织JAK2、STAT3蛋白相对表达量比较无明显差异(表5，图2)。

表5 各组大鼠JAK2/STAT3通路相关蛋白相对表达量比较

图2 各组大鼠JAK2/STAT3通路相关蛋白表达AA.正常组；B.模型组；C.槲皮素组；D.AG490组；E.槲皮素+AG490组

3 讨 论

先兆流产是妊娠最常见的并发症之一，发病率为20%～25%，据统计约25%的患者最终发展为自然流产，严重影响妇女的身心健康[6，7]。先兆流产属于多因素致病，包括母体因素、胚胎因素、不良习惯、内分泌及免疫功能异常、生殖器官疾病(如子宫疾病和生殖道感染)、创伤刺激和环境等[8]。中医认为肾虚、气血亏虚和血瘀引起该病发生，部分患者因素有癥瘕以及既往堕胎史，离经之血日久成瘀，致孕后瘀血不去，胎儿无法得到新血滋养导致流产[9]。西医治疗多以激素类药物为主，不良反应大，保胎成功率低，临床效果不甚理想。中医对其辩证分型为：肾虚型、血热型、血虚型和血瘀型，相应中药治疗方案为补肾填精、固冲安胎，补气养血、固冲安胎，滋阴清热、养血安胎和活血化瘀、固肾安胎，改善妊娠结局疗效显著，不良反应少[10]。

槲皮素及其衍生物是天然植物化学物质，广泛存在于多种中药、蔬菜和水果中，具有良好的生物活性[11]。近年研究显示，槲皮素对心血管疾病、组织器官损伤及恶性肿瘤的防治效果良好[12，13]。Bolouki等[14]研究显示，槲皮素对糖尿病妊娠小鼠子宫接受性标志物和胚泡着床率具有保护作用。Wang等[15]表明，槲皮素可以通过调控小鼠子宫内膜细胞B淋巴细胞瘤-2基因/Bcl-2相关X蛋白凋亡相关蛋白的表达抑制子宫内膜细胞凋亡并有利于胚胎植入。本研究建立先兆流产大鼠模型，经槲皮素预处理及模型制备后继续治疗发现大鼠血清雌二醇、β-HCG、孕激素水平IL-10水平升高，血清IFN-γ和TNF-α水平、流产率、胚胎吸收率降低，卵巢、子宫合重增加，脏器系数升高；HE染色结果显示，大鼠子宫内膜增厚，结节状膨大，腺体数量增加，腺体萎缩明显好转，提示槲皮素对先兆流产大鼠具有保胎作用，可提高其激素水平。

STAT3是一种重要的信号转导及转录活因子，参与包括细胞增殖、分化、迁移、凋亡及免疫调节等多种生物学过程[16，17]。STAT3主要由氨基端保守区、DNA结合区、转录激活区、SH2结构域及丝/酪氨酸磷酸化位点等组成。胞外配体与细胞膜受体结合后构象发生改变，JAK2募集于受体胞浆侧并发生磷酸化，STAT3通过SH2结构域形成同源或异源二聚体，在JAK2激酶作用下，其C端酪氨酸残基被磷酸化，并移位至细胞核，调节下游基因转录与表达，启动一系列信号转导。近年研究发现，子宫上皮STAT3控制子宫腔中狭缝状结构的形成，并且基质STAT3抑制上皮雌激素反应和细胞增殖，影响子宫的接受性和胚胎附着[18]。Yu等[19]发现，亲环素A可通过调控STAT3通路促进小鼠胚胎植入。Fang等[20]发现，早期流产患者的流产组织(绒毛和蜕膜)中STAT3及其下游靶基因的表达显著下调，体外AG490通过抑制STAT3信号通路抑制滋养层细胞的生长并促进其凋亡。本研究发现，槲皮素可以显著上调p-JAK2、p-STAT3蛋白表达激活JAK2/STAT3信号通路，通路抑制剂AG490呈相反作用效果，抑制剂和槲皮素同时处理后，抑制剂对通路相关蛋白表达的抑制作用被逆转，提示槲皮素可能通过调控JAK2/STAT3信号通路对先兆流产大鼠的发挥保胎作用，提高激素水平。

综上所述，槲皮素对先兆流产大鼠具有保胎作用，可提高其激素水平，作用机制可能与调控JAK2/STAT3信号通路有关，为槲皮素相关药物的研发及先兆流产的临床治疗提供理论支持。