石仙桃多糖对帕金森病大鼠模型抗氧化损伤和神经保护作用研究

周乃强 赵世元 梁晓坤

广西壮族自治区崇左市人民医院神经内科，广西崇左 532200

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一种神经损伤和黑质多巴胺神经元进行性损伤导致运动功能障碍的神经系统疾病。帕金森病表现为静止性震颤、僵硬、运动迟缓和逐渐失去正性反射。左旋多巴是治疗帕金森病的主要药物[1]。在帕金森病中，中脑小胶质细胞的过度激活触发了毒性和非记忆性介质的合成，如诱导型一氧化氮和环氧合酶-2（COX-2），并释放自由基，而自由基反过来又导致了人类和动物模型中多巴胺神经元的凋亡[2]。在病理条件下，氧化应激可刺激细胞内信号转导途径，使单核细胞产生大量炎症介质从而促进炎症反应的发生，在帕金森病发生发展过程中伴随着炎症反应[3]，因此靶向抗炎治疗也可作为治疗帕金森病的一种治疗策略。

课题组前期实验表明：石仙桃多糖能抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖[3]。石仙桃多糖对肺炎支原体肺炎模型小鼠有较好治疗效果[4]。本研究将在帕金森动物整体模型基础上，采用电镜、酶联免疫技术、分子生物学等技术，观察石仙桃多糖抗氧化损伤和神经保护作用，为石仙桃多糖开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验药物（石仙桃多糖）的提取

石仙桃多糖（PCLP）的提取参考文献[5]。取石仙桃鳞茎，洗净晒干。1 kg加4 L蒸馏水80℃回流6 h，冷却后加1倍体积95%乙醇沉淀，用丙酮和乙醚萃取沉淀物3次，Sevag法去除蛋白，用95%乙醇沉淀，再将沉淀物水解、醇沉，用丙酮和乙醚脱水，重复操作数次，得石仙桃多糖。经高效色谱检测，在260～280 nm无吸收峰，收集多糖。样品真空包装、冰箱冷藏保存。

1.2 实验动物

120只SPF级雄性SD大鼠，体重200～220 g，由湖南斯莱克景达实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK（桂）2016-0002。大鼠均饲养在22℃、相对湿度为30%且无病原体环境下，单笼喂养，自由进食，自由活动。动物适应2周后可以进行实验。实验严格遵守动物伦理委员会的法律法规，实验均符合动物行为规范。小鼠腹腔注射MPTP 20 mg/kg，每晚1次，连续5 d。行为测试应在最后一次注射MPTP后3天进行。

1.3 主要试剂

6-羟基多巴胺（6-OHDA，美国Sigma公司，批号：20181203）；丙二醛（MDA）试剂盒（碧云天生物技术公司，批号：2019082101）；一抗酪氨酸羟化酶（TH）多克隆抗体（美国Santa Cruz公司，批号：20191103）；肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和核因子κB（NF-κB），以上试剂由南京建成生物工程研究所提供。

1.4 PD大鼠模型制备、实验动物分组及石仙桃多糖给药方法

PD大鼠模型制备参考文献[6]。空白对照组：每只大鼠隔日皮下注射太阳花油10 ml/kg，共9次，每天灌胃生理盐水5 ml/kg；模型组：每只大鼠隔日皮下注射鱼藤酮溶液（用太阳花油溶解，1 mg/kg，共9次），剂量相当于10 ml/kg，并在药物治疗的同时每天灌胃生理盐水5 ml/kg；阳性对照组：每只大鼠隔日皮下注射鱼藤酮溶液（1 mg/kg，共9次），每天用左旋多巴灌胃10 mg/kg。石仙桃多糖低剂量组：每只大鼠隔日皮下注射鱼藤酮溶液（1 mg/kg，9次）并灌胃石仙桃多糖15 mg/kg；石仙桃多糖中剂量组：每只大鼠隔日皮下注射鱼藤酮溶液（1 mg/kg，9次）并灌胃石仙桃多糖20 mg/kg，石仙桃多糖治疗高剂量组：每只大鼠隔日皮下注射鱼藤酮溶液（1 mg/kg，9次）并每天灌胃石仙桃多糖30 mg/kg。每组动物实验从第1天开始，最后一次给药是第18天。给药期间，观察大鼠毛发、进食量、活动情况、精神状况及对刺激的逃避反应。第19天，进行行为学检测，步骤如下。1.4.1 滚轴试验 将大鼠放置滚轴上以4 r/s速度转动，当加速到5 r/s开始计时，当大鼠掉落滚轴时停止计时，记录时间。每分钟检测一次，共检测5次，取平均值。

1.4.2 网格试验 将大鼠置于水平金属网格（12 cm×12 cm，格间距为1 cm）上，大鼠四脚爪均抓住网格线，180°向下翻转网格装置并计时，当大鼠掉落网格时停止计时，悬挂时间超过180 s时均计为180 s，每隔2分钟进行测试一次，共测试5次，取平均值。

运动评估完成后1 d，在氯胺酮麻醉下用颈椎脱臼处死大鼠。在大鼠头骨上开洞，解剖大脑。每个大脑被分成两个独立的半球。右半球立即在液氮中冷冻，随后分离纹状体，用于生化指标检测。左半球用中性福尔马林（1∶10 v/v）固定24 h，将标本用乙醇脱水，用二甲苯清除，并嵌入聚对苯二甲酸乙二醇。在黑质水平切取4 μm厚的切片，用于免疫组织化学。

1.5 纹状体多巴胺和丙二醛水平的测定

先用双缩脲法检测组织匀浆蛋白，再采用荧光分光光度法测定DA，采用分光光度法检测MDA，操作按试剂盒产品使用说明书进行。

1.6 PD大鼠纹状体炎症因子TNF-α、NF-κB和IL-1β的表达测定

从纹状体组织中提取总mRNA，采用Promega结构变异总RNA分离系统进行分离。提取的RNA浓度和纯度用贝克曼DU-6400紫外可见分光光度计进行波普扫描，样本在-80℃下保存。检测TNF-α、IL-1β和NF-κB的表达，使用的特定引物如下： ①NF-κB： 5'-CAATGGCTACACAGGACCA -3'and 5'-CACTGTCACCTG GAACCAGA-3'；②TNF-α： 5'-TCTACTGAACTTCGGGGTGATCG -3'、5'- TGATCTGAGTGTGAGGGTCTGGG -3'；③IL-1β：5'-GCTCATCTGGGATCCTCTCC-3' and 5'- CCTGCCTGAAGCTCTTGTTG -3'；④β-actin ：and 5'-ACGGCCAGGTCATCACTATTG-3'and 5'- CAAGAAGGAAGGCTGGAAAAGA -3'

使用Promega GoTaq®1步RTqPCR系统进行实时PCR。反应混合物包括4 μlRNA模板、1 μl每个引物、10 μl GoTaq®qPCR主混合物、0.4 μl GoScript®RT混合，0.31 μl CXR参考染料，和无核酸酶的水。实时PCR热循环仪（StepOnePlus™；应用生物系统公司，MA，USA）用于检测和收集结果，在37℃下开始反转录15 min。

1.7 黑质酪氨酸羟化酶的免疫组化研究

将脑组织切片（4 μm）在37℃下放置过夜。每组取两片，去乙酰化，再水化，用pH=9 Tris-EDTA洗涤。将原代兔多克隆抗磷酸酪氨酸羟化酶（TH）抗体稀释成1∶800，并用该稀释液滴到组织切片中，在4℃冰箱中孵育过夜，用生物素化二级抗体染色覆盖染色60 min，最后用苏木精复染。用光学显微镜在×100和×400放大倍数下，对每个组织切片中黑质致密部的边界进行检查和成像。

1.8 统计学方法

实验数据采用SPSS 20.0统计学软件进行分析。正态分布资料以（）表示，并用单因素方差分析（ANOVA）和t检验进行分析。不符合正态性分布的数据用K-W方差分析方法进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 石仙桃多糖对鱼藤酮所致PD大鼠行为障碍的影响

模型组大鼠毛发变黄，活动减少，行动迟缓和震颤，精神不振，对刺激反应慢；行为学检测结果，模型组的大鼠掉落滚的时间和掉落网格时间明显较空白对照组缩短，在5 min内表现出更多的停止次数，交叉方块数量较少，活动指数较低（P＜0.05）。与模型组相比，阳性对照组大鼠活动增强，交叉方块数量更多，活动指数更大，停止次数更少；石仙桃多糖组表现轻微。石仙桃多糖高剂量组大鼠，行为学检测试验中记录的交叉方格数增多、停止次数减少和活性指数增加。见图1。

图1 石仙桃多糖对PD大鼠活动行为障碍的影响

2.2 石仙桃多糖对鱼藤酮所致PD大鼠纹状体多巴胺和丙二醛的影响

模型组大鼠纹状体DA水平降低，阳性对照组可增加纹状体DA水平。石仙桃多糖高剂量组显著增加纹状体DA水平，见图2D。模型组纹状体MDA含量较高，阳性对照组和石仙桃多糖低、中、高剂量组均显著降低纹状体MDA的水平（P＜0.05）。与阳性对照组相比，石仙桃多糖高剂量组对MDA水平的作用明显优于阳性对照组（P＜0.05）。见图2E。

图2 石仙桃多糖对鱼藤酮所致PD大鼠纹状体多巴胺和丙二醛的影响

2.3 石仙桃多糖对PD大鼠纹状体炎症因子TNF-α、NF-κB和IL-1β表达的影响

定量PCR检测大鼠纹状体中的炎症因子TNF-α、NF-κB和IL-1β的结果表明，模型组与空白对照组大鼠相比，表达显著增加（P＜0.05），阳性对照组大鼠纹状体炎症因子TNF-α、NF-κB和IL-1β表达下降（P＜0.05）。与模型组相比，石仙桃多糖低剂量组PD大鼠纹状体炎症因子TNF-α、NF-κB和IL-1β表达不显著，石仙桃多糖中、高剂量组PD大鼠纹状体炎症因子TNF-α、NF-κB和IL-1β表达显著降低（P＜0.05）。石仙桃多糖高剂量组大鼠纹状体炎症因子TNF-α、NF-κB和IL-1β呈低表达（P＜0.05），见表1。

表1 PD大鼠纹状体炎症因子TNF-α、NF-κB和IL-1β表达比较（± s）

表1 PD大鼠纹状体炎症因子TNF-α、NF-κB和IL-1β表达比较（± s）

注：与空白对照组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05；与阳性对照组相比，$P＜0.05

组别 TNF-α NF-κB IL-1β空白对照组 2.65±0.35 1.25±0.21 1.86±0.31模型组 19.31±3.56* 24.84±4.25* 17.98±2.84*阳性对照组 7.82±1.26*# 11.25±2.38*# 6.53±1.48*#石仙桃多糖低剂量组 17.85±3.87*$ 22.43±4.56*$ 14.97±1.42*$石仙桃多糖中剂量组 13.26±2.46*# 19.68±3.42*# 10.36±2.48*#石仙桃多糖高剂量组 7.56±1.23*# 6.87±1.47*# 4.24±0.85*#

2.4 石仙桃多糖对PD大鼠纹状体TH的影响

免疫组织HE染色，图3a、b为HE染色黑质神经元的正常外观；模型组TH阳性细胞数量减少，胞浆染色模糊，核固缩，见图3c、d。石仙桃多糖干预处理相对增加了TH阳性神经元的数量，其具有显著的胞浆染色反应，见图3e、f。石仙桃多糖高剂量组大鼠的脑切片显示出对TH的强烈胞浆染色反应和较高百分比的TH阳性神经元，表明石仙桃多糖具有强烈的神经保护作用见图3g。

图3 各组大鼠黑质酪氨酸羟化酶免疫组化HE染色注：图a和b：空白对照组大鼠黑质神经元细胞免疫组化HE染色（×10和×40）；图c和d：模型组TH阳性细胞数明显减少（×10）；图e和f：石仙桃多糖中、低剂量组的TH阳性细胞数明显比模型组多（×10和×40）；图g：石仙桃多糖高剂量组出现较多的TH阳性数目；图h：阳性对照组TH高表达（×10和×40）

3 讨论

石仙桃属（Pholidota）是兰科（orehidaeeae）植物，别名石橄榄、石上仙桃和石上莲等。石仙桃的主要成分是多糖，含量2.25%[7]。研究发现多糖具有抗病毒、抗炎、抗肿瘤、抗凝血、降糖等多方面的生物活性[8]。本课题组采用石仙桃多糖，通过建立肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）肺炎模型BALB/c小鼠模型，通过定量培养肺泡灌洗液（BALF）肺炎支原体、肺组织病理学评分（HPS）和检测BALF中IFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-12等的表达，探讨石仙桃多糖治疗肺炎支原体肺炎小鼠的可能作用机制。研究结果：石仙桃多糖干预肺炎支原体模型小鼠1～3 d，能迅速调节MPP小鼠体内的免疫功能，小鼠BALF中IL-1β、IFN-γ、IL-12、TNF-α等细胞因子明显下调，辅助性Th1细胞因子明显降低，小鼠肺部炎症明显减少，其作用机制可能参与调节肺炎支原体模型小鼠体内Th1/Th2细胞有关[9]。

帕金森病是一种神经退行性疾病，主要由纹状体多巴胺能神经元损伤引起。一些与氧化应激和炎症有关的生化异常也在帕金森病脑中被发现[10]。临床和动物研究的数据表明，神经炎与帕金森病病理学及神经退行性机制相关[11]。 鱼藤酮是一种高亲脂性杀虫剂和除草剂，它容易穿过生物膜，常用于诱发帕金森病运动功能障碍动物模型。其机制是阻断复合体I中的线粒体电转运链，从而降低选择性影响黑质神经元的氧化磷酸化。鱼藤酮作为检查啮齿类动物氧化应激所致多巴胺能损伤机制的一个有价值的工具，氧化应激在帕金森病的病理学中起着重要作用。应用鱼藤酮建立的PD动物模型不仅很好地模拟PD突触核蛋白聚集和路易小体形成，而且还可以复制PD的所有症状[12]。

在本研究中，模型组引起的运动障碍类似于帕金森病，滚轴实验和网格试验中，大鼠停止次数增加，交叉方块减少，活动明显减少。与模型组相比，石仙桃多糖高剂量组大鼠这种运动障碍得到改善，其方形数量增加，停止次数减少。石仙桃多糖高剂量组纹状体多巴胺水平高于模型组；石仙桃多糖低、中剂量组处理PD模型导致纹状体多巴胺水平略有增加，但不足以显著改善运动行为。

细胞因子在神经退化过程中起重要作用。在帕金森病患者中，研究显示NF-κB向细胞核的易位显著增加[13]，并伴有诱导的细胞因子转录[14]。此外，发现帕金森病患者大脑中IL-1β、IL-6、IL-2和IL-4水平上调[15]。本研究结果表明，模型组纹状体中TNF-α、IL-1β和NF-κB的表达水平较高。石仙桃多糖高剂量组大鼠上述细胞因子表达大幅下降。与模型组相比，石仙桃多糖高剂量组免疫组化出现的TH神经元数量增加，本研究结果与Strathern等[16]实验结果一致。

综上所述，本研究表明石仙桃多糖具有显著的抗氧化、抗损伤和神经保护作用。本研究初步认为，石仙桃多糖神经保护活性可能与其消炎抗菌作用有关，课题组将在动物实验基础上进行深入临床研究。