影响绵羊精液冷冻保存效果的因素

任李俊，王 智，朱大伟，张利坤，胡建宏

(1.白水县同羊原种场，陕西 白水715600；2.西北农林科技大学 动物科技学院)

随着我国社会经济的不断发展，人民的生活质量和消费水平也正在逐渐提高，羊肉已经成为我国城乡居民日常消费的重要畜产品之一，而羊肉的巨大需求量促使我国的对于绵羊的养殖方式逐步从农户散养转变为规模化、集约化舍饲养殖。随着养殖方式的现代化转变，人工授精技术在规模化养殖中得到大力推广，对于优质绵羊冷冻精液的需求量也正在逐渐增大。使用优质绵羊的冷冻精液进行人工授精可有效发挥优秀种公羊的生产性能，提供种公羊的利用率，可以有效改善羊群结构，加快良种绵羊的繁殖效率。冷冻精液解冻后的品质可直接影响人工授精后母羊的受胎率、产羔数等，精液在冷冻保存程序过程中精子的结构以及功能容易受到外界环境(温度、渗透压、pH等)影响造成一定的损伤，从而导致解冻后精子活率较低、顶体完整率和质膜完整率降低，影响精液的品质。本文从精液稀释液的理化指标、冷冻-解冻方法、温度等因素对绵羊精液冷冻保存保存效果的影响进行综述，以期为绵羊的冷冻保存技术应用推广提供参考。

1 稀释液对精液品质的影响

1.1 pH

在精液冷冻过程中，pH是影响精液冷冻保存效果的重要因素，在精液稀释中pH的剧烈变化可直接导致精子的死亡。绵羊精液的pH为7.0～7.2，稀释液pH偏碱性时会加快精子的代谢活动，同时会降低精子的存活时间。目前研究普遍认为精液稀释液在冷冻保存过程中随着保存时间的延长pH逐渐降低至偏酸性，稀释液偏酸性时可抑制精子的代谢活动，有利于精液冷冻保存。Liu等的研究表明，精液冷冻解冻后精子的活率与稀释液pH呈强相关性，在稀释液中添加柠檬酸盐、重碳酸盐等盐类物质可维持稀释液pH的稳定。马玉英等研究表明，萨福克羊精液稀释液的pH维持在6.0～7.0时，精液冷冻解冻后精子活力效果较好。精液稀释液中加入糖类物质如环糊精、葡萄糖、果糖等，精子可利用稀释液中的糖类进行能量代谢并可生成乳酸盐等弱酸物质，从而形成弱酸环境，有利于精液冷冻保存。宋玉坤等研究表明，在稀释液配方中加入1%十二烷基硫酸钠、Tris-葡萄糖-柠檬酸钠可显著提高精液冷冻保存效果。李方舟等研究表明，在稀释液中联合添加1.0 mg/mL海带多糖+2.0 mg/mL枸杞多糖可显著提升精液冷冻保存效果。

1.2 渗透压

在精液冷冻过程中，渗透压对于对于精液冷冻保存效果有重要的影响，精子与精液稀释液应基本保持等渗状态。若精液稀释液中盐类浓度较低，精子会从稀释液中吸水而膨胀，导致精子运动速度降低，甚至涨破死亡，反之则精子会脱水，稀释液中盐类浓度过高过低均会导致精液品质降低，因此保证适宜的渗透压并维持稳定可有效降低精子的损伤。目前研究普遍认为精子可以适应的渗透压范围为240～350 mOsm/L，在此范围内对精子损伤较低。张亚妮等研究表明，在绵羊常温保存中稀释液的渗透压为339 mOsm/L时精子的活力显著高于渗透压为280 mOsm/L。刘福元等研究发现，绵羊低温保存中稀释液渗透压梯度为260、300、340、380、420、420、460 mOsm/L时，渗透压为340 mOsm/L的精液中精子有效存活时间、存活时间最高。稀释液中添加缓冲物质可有效维持精液内渗透压，常见物质主要有糖类、盐类、磷脂类等。糖类物质主要有环糊精、葡糖糖、果糖，可为精子提供代谢能量同时可调节精液内渗透压。盐类物质主要有柠檬酸盐、磷酸盐、重碳酸盐等。宋玉坤研究表明，在精液冷冻稀释液中添加卵黄可为精子提供代谢能量同时可以将稀释液的渗透压维持在370 mOsm/L，可降低精子在精液冷冻保存中精子顶体、质膜的损伤，提高冷冻解冻后精液品质。

2 冷冻-解冻方法对精液品质的影响

精液的冷冻-解冻方法对于解冻后精液品质具有重要影响。精液的冷冻过程主要分为精液平衡和冷冻两个过程，其中精液平衡是指将精液稀释后由37 ℃缓慢降温到5 ℃，共平衡2.5～3 h；精液冷冻是指将平衡好的精液通过冷冻漂浮器放置于液氮表面进行熏蒸缓慢降温，熏蒸约5 min后可放置于液氮进行冷冻保存。陈亚明等研究发现，使用不同体积的水浴包被和8层纱布包被放入冰箱降温平衡，其中250 mL水浴包被和200 mL水浴包被平衡时间为2.0 h和2.5 h冷冻精子的活率、生存指数、顶体完整率等均高于其他组。邓雯等研究发现，绵羊精液采用250 mL水浴降温平衡、时间约为3 h时较为适宜，精子解冻品质最好。

目前常用的绵羊精液冷冻方法有液氮熏蒸法和程序冷冻仪法，液氮熏蒸法需要控制精液细管与液氮液面的高度差来控制温度的降温速率，保国俊等研究发现种公羊冻精制作时熏蒸距离与熏蒸时间是正相关的，最佳熏蒸距离为2 cm最佳熏蒸时间为7 min，解冻后精子的活率可达到42.33%。程序冷冻仪法是由电脑程序调控降温速率。王新奇等研究发现，使用液氮熏蒸发和程序冷冻仪法进行精液冷冻时，采用程序冷冻仪法冷冻后精子活率和质膜完整性显著高于液氮熏蒸法，使用液氮熏蒸法需要严格控制细管与液氮液面的距离，受客观因素影响较大，程序冷冻仪法是比较理想的冷冻方法。

在精液解冻操作中，将冻精细管从液氮中取出迅速浸入39～45 ℃恒温水浴锅，轻轻摇动至融化(10～15 s)，融化后可进行精液品质鉴定或者直接使用。张子军等研究发现，精液在解冻后的活率与解冻时的温度差异不明显，但受稀释液的配方物质影响较大，解冻温度较高时需要进行的操作及所需配方更为复杂，适宜的解冻温度为42～45 ℃，解冻后精子的活率达到0.4。

3 温度对精液品质的影响

在精液冷冻保存中，温度的变化主要有三个阶段：平衡阶段精液38 ℃降低至4～5 ℃、冷冻熏蒸阶段精液温度降至-196 ℃、冻融阶段精液温度升至38 ℃。在平衡阶段精液温度降低过程中，精子极容易发生不可逆损伤甚至死亡，这种现象叫做冷休克。邓雯等研究发现，精液平衡时降温速率控制在前30 min为0.73～0.74 ℃/min，30～90 min降温速率应控制在0.11～0.12 ℃/min，平衡时间为3 h，精子的冷打击最小。

精子在熏蒸降温和冻融升温时温度在0～-60 ℃时，精子内部自由水容易形成冰晶化结构，精子内部的冰晶化结构极易对精子内部造成物理性损伤。温度降低速率过快时，冰晶化速度越快对应冰晶结构越大，损伤越高；温度升高速率过慢时，精子内部自由水形成冰晶，使精子内盐类物质浓度升高渗透压增加，精液由于在最外部解冻后使大量水分进入精子，导致精子膨胀甚至死亡，同时形成的冰晶化会造成物理性损伤。降温速率越慢，对精子损伤越大，精液品质越低。王新奇研究发现，在4～-60 ℃的降温速率为20 ℃/min、降温时间约为3.75 min，冻融时水浴温度为40 ℃、解冻时间为10 s，冷冻-解冻后的精液质量最好，解冻后精子活率、顶体完整率和质膜完整率分别达到37%、41.18%和47.62%。在精液冷冻保存中通常可加入抗冻物质从而降低温度变化对精子的超微结构和生物及功能上的损伤，常用的抗冻物质有甘油、卵黄、大豆卵磷脂、乙二醇与二甲基亚砜(DMSO)等。其中甘油的最适添加浓度范围为6%～8%，卵黄的常用浓度为15%～20%，DMSO的适宜浓度为5%左右。

4 小结展望

随着绵羊养殖的规模化、集约化发展，人工授精技术得到更加广泛的应用，对于优质种公羊精液的需求促使了精液冷冻保存技术的发展，绵羊精液冷冻保存技术可以实现优秀种公羊的优质精液的大范围、跨地域使用，大大提高优秀种公羊的利用率，提高生产效率增加经济效益，同时可加快绵羊的育种改良进程。精液冷冻保存目前研究的热点在于稀释液、保护液的配方改良，主要在于添加剂的研究包括其主要性能及功能机制，如某些植物提取物、糖类等。但目前的研究的多种添加剂配方制作冻精多数停留于试验阶段，未进行最终绵羊人工授精来判断其最终效果。所以加强探索冻精在绵羊具体生产实际中的应用效果，可对于精液冷冻保存技术的发展提供实际指导。