超高效液相色谱-串联质谱法测定β-受体激动剂残留量的研究

何冲 王彬 贾亦森 张利娟

摘 要：建立了同时测定动物源性食品中、饲料及尿液中17种β-受体激动剂残留量的超高效液相色谱-串联质谱方法（UPLC-MS/MS）。样品经粉碎后用试样经含2%甲酸水-乙腈-甲醇溶液匀浆提取，离心后，上清液经净化后，用高效液相色谱-串联质谱测定，分别采用内标法和外标法定量。结果表明，17种β-受体激动剂在一定质量浓度范围1.0～10.0 μg/kg（肾上腺素为50～500 μg/kg）呈现出良好的线性关系，相关系数R2>0.99;从1.0 μg/kg、2.0 μg/kg和10.0 μg/kg（肾上腺素为50 μg/kg、100 μg/kg和500 μg/kg）3个添加浓度的检测结果中可以看出，17种化合物的回收率为67%～110%。

关键词：超高效液相色谱-串联质谱（UPLC/MS-MS）;β-受体激动剂;动物源性食品;飼料

Determination of the β-agonist Residues by Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

HE Chong， WANG Bin， JIA Yisen， ZHANG Lijuan

（Shanxi Institute of Product Quality Supervision and Inspection， Xi'an 710048，China）

Abstract：The method for the simulataneous determination of seventeen β-agonists residues in animal derived foods、feed and urine samples was developed by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC/MS-MS）.The sample was extracted in 2% formic acid/water-acetonitrile-methanol solution .The extraction was applied to a solid phase extraction cartridge for cleanup， determined by MRM， quantified by internal and external standard method.The calibration curves were goog liner between the peak arears and the concentrations of 1.0～10.0 μg/kg（The adrenaline 50～500 μg/kg） with the correlation coefficient R2>0.99.The average recoveries from spiked animal issues at three concentrations of 1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、10.0 μg/kg （The adrenaline 50 μg/kg、100 μg/kg、500 μg/kg） ranged 67%～110%.

Keywords：ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC/MS-MS）; β-agonists; animal derived food; feed

β-受体激动剂类的使用可影响营养物质在动物体内的流向，从而有效地促进肌肉组织生长，降低体内脂肪含量，提高动物瘦肉率[1]。竞技运动员食用可以增加肌肉/脂肪比并提高肌肉力量，同时还对呼吸系统和神经系统有兴奋作用[2]。

目前，关于β-受体激动剂类的检测有HPLC法，GC/MS法、LC/MS法以及免疫法和毛细管电泳法等。液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS法）在20世纪80年代后迅速发展并逐渐成熟，在药物分析、法医学、商检、环境科学、生命科学等领域都得到了广泛的应用[3]。现在，几乎所有类的β-受体激动剂都可以用LC-MS/MS法来检测，但大部分检测方法的前处理十分复杂，步骤烦琐，目标物回收率过低。同时不同基质（如食品、饲料、尿液等）[4-6]无法同时处理，时间、试剂和耗材的消耗量过大使现有方法难以实现大批量样品的快速检测[7]。本文所研究的方法在满足检出限和回收率要求的前提下，简化了样品前处理的步骤，并且该方法同时适用于食品、饲料和尿液的检测。

1 材料与方法

1.1 仪器

超高效液质联用仪，Thermo Fisher TSQ&Endura;电子天平，赛多利斯科学（北京）公司BSA224S;涡旋混匀器，Scientific Industries Vortex Genie 2T;冷冻离心机，长沙湘仪离心机有限公司H2100R;全自动SPE，上海屹尧仪器科技发展有限公司EXTRA;氮吹仪，得泰仪器科技有限公司FV64。

1.2 试剂和耗材

甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯;所用水为超纯水;Captiva EMR-Lipid净化包（安捷伦）;Captiva RC针式过滤膜（安捷伦）;17种β-受体激动剂标准物质及9种同位素内标信息详见表4。

1.3 标准曲线的配制

用甲醇分别将标准物质及同位素内标配制成浓度为10 μg/mL的储备液（-18 ℃避光保存）。再分别精确吸取适量的储备液配制成浓度为100 ng/mL的混合标准溶液和混合内标溶液（肾上腺素除外）。加入适量混合标准溶液和混合同位素内标溶液，用水稀释成标准工作溶液。现配现用。

1.4 样品前处理

准确称取2 g（精确至0.01 g）试样置于50 mL具塞离心管中，加入混合同位素内标液，涡旋混匀。加入2 mL的2%甲酸水溶液和陶瓷均质子高速匀浆2 min，再加入8 mL甲醇︰乙腈（6︰4）涡旋振荡5 min，4 ℃低温9 000 r/min离心5 min。取5 mL上清液，加入到Captiva EMR-Lipid重力自流并收集（上样后可以适当增加压力，保证流速在1滴/s左右，速度不要过快），待液体流干后加入2 mL的2%甲酸水︰乙腈（2︰8）洗脱，抽干，收集所有洗脱液。40 ℃氮吹至干，准确加入1 mL水超声复溶，过Captiva RC针式过滤膜，上机待分析。

1.5 液相色谱-串联质谱检测

1.5.1 液相色谱条件

色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）或性能相当者;流动相：A为含0.1%甲酸水溶液，B为甲醇。流速：300 μL/min;柱温：40 ℃;进样量：5 μL，梯度洗脱程序见表 1。

1.5.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI+）;检测方式：多反应监测（MRM）;喷雾电压：3.5 kv（ESI+）;离子传输管温度：350 ℃;雾化器温度：300 ℃;鞘气压力：30 Arb;辅助器压力：10 Arb;扫气压力：0 Arb。

1.6 定性与定量

在相同试验条件下测定试样和浓度相近的标准工作溶液，记录试样和标准工作溶液中的色谱保留时间，以相对于最强离子丰度的百分比作为定性离子的相对离子丰度。若试样中检出与标准溶液中兴奋剂保留时间一致的色谱峰，且其定性离子与浓度相当的标准溶液中相应的定性离子的相对丰度相比，偏差不超过表2规定的范围，可以确定试样中检出相应的目标物。

根据试样中目标物的含量情况，选取浓度相近的混合标准工作液进行液相色谱-质谱/质谱分析。混合标准工作液和待测液中目标物的响应值均在仪器线性响应范围内。以色谱峰面积按内标法和外标法分别定量。

2 结果与分析

2.1 17种β-受体激动剂及内标总离子流图谱

图1为17种β-受体激动剂以及其相对应的内标的标准溶液总离子流图谱，从图中可以看出目标物在该色谱条件下分离度较好、质谱响应值完全满足信噪比要求，液相和质谱条件均能满足后续实验要求。

2.2 线性关系

17 种 β- 受体激动剂标准曲线见表3。

2.3 准确度和精密度

分别在样品中添加17种兴奋剂检出限、定量限和10倍检出限浓度的目标物进行样品的回收率实验，结果见表4。实验结果表明本方法在1～10 ?g/kg（肾上腺素50～500 ?g/kg）添加浓度范围内，回收率为67%～110%。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。

3 结论

与目前国内通用方法相比，本研究在满足国家标准对检出限、稳定性和精密度要求的前提下极大地简化了实验步骤，缩短了样品前处理的时间。同时本实验对动物源性食品、饲料和尿液等不同基质中17种β-受体激动剂残留量都进行了检测研究，结果表明该方法还具有广泛的应用性。解决了现有方法中不同基质需要采用不同前处理方法的问题。

参考文献

[1]COURTHEYN D，IE-BIZEC B，BRAMBILLA G，et al.Recent developments in the use and abuse of growth promoters[J].Analytical Chimica Acta，2002（1）：71-82.

[2]閆翠花.08奥运会禁用的兴奋剂分类及作用[J].中国药物滥用防治杂志，2010，16（1）：25-27.

[3]朱坚.气相色谱-质谱法测定肝、肾和肉中11中β-受体激动剂残留量[J].质谱学报，2005，26（3）：12937.

[4]秦旸，徐友宣，杨树民，等.液相色谱-质谱联用在兴奋剂检测中的应用及进展[J].色谱，2008（4）：431-436.

[5]国家质量监督检验检疫总局.动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定 液相色谱串联质谱法：GB/T 22286—2008，北京：中国标准出版社，2008.

[6]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.饲料中沙丁胺醇、莱克多巴胺和盐酸克仑特罗的测定 液相色谱质谱联用法：GB/T 22147—2008[S].北京：中国标准出版社，2008.