引进的香蕉种质资源对云南枯萎病菌株的抗性评价

刘立娜，杨宝明，王永芬，3，曾 莉，黄玉玲，李永平，尹可锁，李迅东，彭学彬，徐胜涛，番华彩，白亭亭，张 晶，4，李 舒，郑泗军，5

(1 云南省农业科学院农业环境资源研究所/云南省农业跨境有害生物绿色防控重点实验室，昆明，650205；2 云南农业大学/省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室，昆明，650201；3 云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所，云南保山，678000；4 云南大学农学院/云南大学资源植物研究院，昆明，650500；5 国际生物多样性中心，昆明，650205)

香蕉在热带和亚热带国家是非常重要的经济作物和粮食作物之一[1]。然而，全球香蕉产业发展正受到枯萎病的严重威胁。云南作为我国香蕉重要产区之一，大面积栽培的优良品种巴西蕉是易感病品种，缺乏综合农艺性状良好的抗病种质资源[2]。因此，遴选和储备抗病香蕉种质资源对云南有效防治香蕉枯萎病具有战略性的意义。香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型Fusariumoxysporumf. sp.cubense侵染引起的维管束坏死的真菌病害，其分布广、扩散快、毁灭性强、尚无有效的防控措施[3-4]。特别是4号生理小种热带型(TR4)为害尤为严重，大量香蕉种植园因TR4而被撂荒[5-7]。香蕉无性繁殖和遗传基础单一加大了传统方法选育抗病种质资源的应用难度，在现有香蕉资源中遴选抗病种质资源对于防控TR4十分关键。传统的抗病性评价通常在田间进行，对亲本品系的选择至关重要，但是该种评价方式耗时耗力，病原菌在大田分布不均匀且需要大量农田[8]。温室枯萎病抗性的评价利用有限空间、可控生长条件和防止其他生物交叉感染等方面优势，大多数种质资源的评价周期短且评估准确[9-10]。蒲金基等认为香蕉对枯萎病的抗性不仅与寄主本身的遗传特性有关，还会受到病原菌种类、浓度以及环境因素的影响[11-12]。由于各个香蕉产区枯萎病菌的遗传背景不同，在一地表现抗病的种质资源很可能在其他环境中表现为感病[10]。研究表明不同来源的菌株对寄主植株表现出不同的致病力[13]，香蕉对不同来源的TR4响应中也发现了差异，GCTCV-119在苗期接种TR4菌株VCG01213/16表现为抗病，对TR4菌株FOC35表现为中抗[9，14]。VCG01213/16分离于广东省，而FOC35由中国热带农业科学院分离于海南省，因此分离于不同地区的TR4菌株致病力和致病寄主范围都有可能存在差异。基于我们已从国际生物多样性研究中心引进百余份香蕉种质资源和在云南西双版纳分离到强致病力的TR4菌株[10，15]，本研究在温室内测定不同浓度云南菌株TR4(15-1)侵染下香蕉种质资源球茎的病情指数，评估香蕉种质资源对云南菌株TR4(15-1)的抗性，确定具有抗性的种质资源；结合本文香蕉种质资源对其他来源TR4菌株侵染的响应，筛选具有广谱抗病性的香蕉种质资源，为云南产区香蕉抗病资源的储备、抗病种质资源的应用和抗病基因的筛选提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

从国际生物多样性研究中心引进，保存于云南省农业科学院的11份香蕉种质资源，种质资源信息见表1。11份种质资源包含有AA基因型2份，AAA基因型8份，AAB基因型1份，其中Pahang为抗病种质，Baxi Jiao为感病种质。

供试病原菌为在云南西双版纳分离的强致病性野生型菌株TR4(15-1)[10，15]。

表1 11份保存于云南省农业科学院的香蕉种质

1.2 香蕉幼苗培养

供试11份香蕉种质资源组织培养幼苗在椰糠基质中培养约6周，生长至高10 cm后接种菌株TR4(15-1)，每份种质每批接种20株以上，2019年7月和2019年8月分别接种2批。

1.3 菌株TR4(15-1)孢子的培养

将-80 ℃保存的菌株TR4(15-1)接种于PDA平板上，28 ℃黑暗培养7 d产孢，用无菌水洗脱PDA平板上的分生孢子，注入装有300 mL PDA液体培养基的锥形瓶中，25 ℃下150 rpm摇瓶培养3 d；两层纱布过滤去除菌丝，采用血球计数板在显微镜下将孢子液浓度调整至1×106个孢子/mL和1×108个孢子/mL。

PDA培养基配置方法：去皮马铃薯200 g，切成小块，用1 000 mL水煮沸15 min，四层纱布过滤去马铃薯残渣，加入葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，加水定容至1 000 mL，121 ℃高压灭菌20 min。PDA液体培养基为不加琼脂粉的PDA培养基。

1.4 接种方法

采用伤根浸菌法接种[16]，略作修改。取出椰糠中培养的香蕉苗，把待接种的香蕉苗按照种质资源编号有序取出摆好，用剪刀将香蕉苗根系修剪至长5 cm左右，将根浸没于孢子悬浮液中(浓度分别为1×106个孢子/mL和1×108个孢子/mL)，间隔5 min搅拌1次悬浮液；30 min后取出浸泡香蕉苗移栽于混合基质土(质量250 g)的盆钵中，再分别以接种量1×106个孢子/mL和1×108个孢子/mL灌根。

1.5 病情指数调查

分别在接种14 d和20 d解剖球茎调查发病情况，枯萎病情况按照0～4级分级[17]，计算病情指数。病情指数=Σ(各级病株数×相应级数)/(调查总株数×最高级数)×100。采用SPSS 16.0软件对数据进行统计分析，TTEST进行差异显著性检验。

1.6 抗病性评估

不同种质资源的抗病性评估参考文献[9]，根据接种后20 d病情指数将香蕉种质资源对TR4的抗性分为6个等级，分别为植株免疫(I)，病情指数=0；高抗(HR)，0<病情指数<20；抗病(R)，20≤病情指数<40；中抗(MR)，40≤病情指数<60；感病(S)，60≤病情指数<80；高感(HS)，80≤病情指数≤100。

2 结果与分析

2.1 香蕉种质对云南菌株TR4(15-1)侵染的响应

试验结果看出，不同种质资源接种菌株TR4(15-1) 1×106个孢子/mL后14 d和20 d，抗病种质Pahang病情指数分别为10.42和28.57，感病种质资源Baxi Jiao病情指数分别为43.75和79.43，表明接种数据可靠，可用于进一步分析。接种后14 d，Baxi Jiao的病情指数显著高于其他种质，其他种质之间病情指数无显著性差异；接种20 d，Baxi Jiao、Banksii、Ibwi的病情指数显著高于Kazirakwe、Igitsiri、Mbwazirume、Inkira以及抗病种质Pahang。抗病种质Pahang与Kazirakwe、Igitsiri、Mbwazirume、Inkira接种14 d的病情指数范围为3.12～18.75，接种20 d的病情指数范围为20.31～29.27，划分等级为抗病R。香蕉种质资源Akpakpak病情指数高于Pahang，分别为28.75和40.42，显著低于感病种质资源Baxi Jiao，抗性等级为中抗MR。说明接种TR4(15-1) 1×106个孢子/mL条件下，Kazirakwe、Igitsiri、Mbwazirume、Inkira、Pahang是云南菌株TR4(15-1)的抗病种质资源。

11份香蕉种质资源接种菌株TR4(15-1)1×108个孢子/mL后14 d和20 d，Pahang的病情指数分别为21.25和31.25，为抗病种质资源；Baxi Jiao为感病种质资源，病情指数分别为71.25和70.31，表明接种条件可靠。接种14 d，Baxi Jiao和Banksii的病情指数显著高于其他种质。接种20 d，Baxi Jiao、Banksii、Ibwi、GCTCV-19、Gros Michel的病情指数显著高于Kazirakwe、Igitsiri、Mbwazirume、Inkira、Akpakpak以及Pahang。抗病种质资源Pahang与Kazirakwe、Igitsiri、Mbwazirume、Inkira、Akpakpak接种20 d的病情指数范围是21.87～39.06，抗病等级为抗病R(见表2、图1和图2)。说明病菌高浓度条件下，Kazirakwe、Igitsiri、Mbwazirume、Inkira、Pahang仍然是云南菌株TR4(15-1)的抗病种质。

表2 11份香蕉种质接种枯萎病菌TR4(15-1)不同浓度孢子悬浮液后病情指数比较

图1 11份香蕉种质接种香蕉枯萎病菌TR4(15-1)1×106 个孢子/mL后解剖球茎变化

图2 11份香蕉种质接种香蕉枯萎病菌TR4(15-1)1×108 个孢子/mL后解剖球茎变化

2.2 香蕉种质对菌株TR4(15-1)不同浓度菌液的响应差异

试验结果看出，Pahang、Igitsiri、Mbwazirume和Inkira病情指数在接种常规浓度(1×106个孢子/mL)条件下小于接种高浓度(1×108个孢子/mL)，但数据无显著性变化，均为抗病R；Baxi Jiao、Banksii、Ibwi 3份种质在接种低浓度和高浓度条件下均划分为感病种质；Gros Michel和GCTCV-119在不同浓度条件下病情指数变化较大，等级由中抗MR到感病S(见图3)。说明对接种不同浓度菌株响应相同的香蕉种质资源占81.82%，相关系数R2>0.78；香蕉种质资源接种常规浓度即可明确其对菌株TR4的抗病等级。

注：线圈代表病情指数。

2.3 香蕉种质对不同来源菌株TR4的响应差异

试验结果看出，9份种质对不同来源菌株TR4的抗病性基本一致，占比为81.83%。差异较大的种质资源是Banksii和Ibwi，它们对广东菌株TR4(VCG01213/16)表现为抗病，对云南菌株TR4(15-1)表现为感病。

筛选的6份抗病种质，即Kazirakwe、Igitsiri、Mbwazirume、Inkira、Akpakpak、Pahang在不同来源菌株TR4侵染下，均表现为抗病，具有广谱抗病性(见表3)。

表3 11份香蕉种质资源对不同地区香蕉枯萎病菌4号生理小种的抗性评估

3 结论与讨论

香蕉枯萎病已成为全球香蕉产业和粮食安全的主要威胁[19-20]，抗枯萎病种质资源筛选是有效利用抗病材料或抗病基因的前提[21]。田间抗病性评价耗时耗力，需要大量农田，且评估可重复性较差[8]。温室枯萎病抗性评价可以在有限的空间、可控的条件下进行，可防止其他生物的交叉感染，且周期短，评估准确性高[10，18]。因此，我们选择在温室对引进的11份香蕉种质资源进行抗病性评估。试验筛选出6份抗病种质资源，即Kazirakwe、Igitsiri、Mbwazirume、Inkira、Akpakpak、Pahang，下一步将在西双版纳枯萎病重病基地进行这些种质农艺性状和大田抗性的进一步评估。

高接种量可用于鉴定高抗性种质资源[10]。一般当接种浓度达到103个孢子/mL，感病种质即可发病。试验中，接种TR4(15-1)高浓度1×108个孢子/mL时，Kazirakwe、Igitsiri、Mbwazirume、Inkira、Akpakpak、Pahang仍然表现为抗病，接种20 d的病情指数范围是21.87～39.06，接近抗病种质Pahang的病情指数31.25，抗病等级为抗病R。因此，对于云南菌株TR4(15-1)，这6个种质是抗病种质。

香蕉种质资源对枯萎病的抗性主要取决于寄主本身的遗传特性[9，14]，虽然受到病原菌接种剂量的影响，但大多数香蕉种质资源抗病等级一般不会变化。抗病香蕉种质接种高浓度的云南菌株TR4(15-1)后病情指数大于常规浓度接种，这主要由于接种剂量影响感染速度[8]。在植物组织中检测到孢子数量与一些物种的抗性水平显著相关，如苜蓿，鹰嘴豆等[22-23]，除GCTCV-119和Gros Michel外，本研究未发现同一种质在不同浓度间的抗性存在显著性差异。

各香蕉产区枯萎病菌的遗传背景不同，表现抗病的种质资源很可能在另一地就表现为感病[24]。本研究收集了11份香蕉种质对广东菌株TR4(VCG01213/16)侵染的影响，在云南菌株1×106个孢子/mL接种浓度下，除Banksii和Ibwi两份种质由抗病变为感病，其余种质抗病情况基本一致，占比达81.82%。因此，香蕉种质资源对TR4的抗病性受TR4菌株来源、菌株浓度的影响，但具有决定性的因素仍然是香蕉种质资源本身的遗传特性。

GCTCV-119在苗期接种广东菌株TR4(VCG 01213/16)表现为抗病[18]，对海南菌株TR4(FOC 35)表现为中抗[14]，云南菌株TR4(15-1)常规浓度侵染下表现为中抗，高浓度下表现为感病。GCTCV-119是目前认可的抗病种质资源，而不同研究中其抗病性不一致。一方面可能由于接种菌株及接种量的差异[11，22-23]，我们选择的TR4菌株为强致病力菌株15-1[10]，且接种量极高。Banksii和Ibwi两份种质对TR4(VCG 01213/16)和TR4(15-1)的抗性由抗病变为感病，也表明我们使用的菌株具有较强致病性。另一方面可能与植物的生长发育时期相关，植物对多种病害的抗性可能受其生长时期的影响[25-26]。成熟植株的抗性明显强于幼苗[27]，成熟植株的免疫反应和细胞保护结构均增强(如细胞壁加厚)，有助于其抵抗病原菌侵害。香蕉种质资源的组成型抗性和诱导抗性是其对病原菌抗性的共同原因[28]。研究显示GCTCV-119虽然在苗期表现为感病，但是在田间表现为抗病[11]，我们在西双版纳枯萎病重病基地的田间初步调查结果也支持GCTCV-119为抗病种质资源。

植物对病原菌侵染的响应取决于植物、病原菌和环境等因素，研究结果表明香蕉种质资源对枯萎病菌的抗性主要决定于寄主本身的遗传特性。因此，筛选云南菌株TR4(15-1)抗性香蕉种质资源，应用抗病种质资源和抗病基因科学防控云南香蕉枯萎病至关重要。我们评估了11份香蕉种质资源对云南菌株TR4(15-1)及其不同浓度的抗病性，筛选了6份高抗病种质资源，且这些资源对不同来源TR4菌株均表现为抗病，对TR4的抗性具广谱性；而Banksii、Ibwi、GCTCV-119、Gros Michel这4份种质资源对不同来源菌株和不同菌株浓度的响应变化较大。本试验结果为云南香蕉种质资源的多样性利用，抗枯萎病种质资源的应用奠定了基础。