Box-Behnken设计响应面法优化啤酒花中α-酸及β-酸超声提取工艺

段海涛 姚 婷 黄安群 郭诚诺 张景峰 李 俊 耿启泉 张爱玲

(1.河南牧业经济学院动物科技学院，郑州 450046；2.北京市饲料监察所，北京 100107；3.中国农业科学院饲料研究所，北京 100081；4.卫辉市农业农村局，卫辉 453100；5.山东鲁莘饲料集团有限公司，聊城 252000)

啤酒花(HumuluslupulusL.)，也可称为酒花、酵母花、蛇麻花等[1]，是传统的中药之一，有健胃、安神[2-3]、抗氧化[4]、化痰止咳、抗菌消炎[5-6]等功效。2019年1月25日，欧盟批准啤酒花抽提物(HumuluslupulusL.flos)作为饲料添加剂用于断奶仔猪、育肥猪等。

目前，国内外啤酒花提取工艺具有一定的研究进展。艾娜丝等[7]对啤酒花精油超临界CO2萃取工艺进行了优化。Latif等[8]研究了酶解辅助提取啤酒花精油。白璐[9]利用响应面法优化微波提取啤酒花α-酸的工艺，提取溶剂为有机溶剂。目前，啤酒花的有机溶剂提取研究较多[10-12]，但有机溶剂的挥发及后续处理问题较为复杂，不利于行业健康可持续发展。

提取条件如溶剂类型、超声功率及温度等均对提取率产生显著影响[13-14]，超声提取中关于料液比、提取时间及提取温度这3个因素对α-酸和β-酸提取率的影响研究较少。常规单因素试验优化提取条件不仅耗时，且需要大量试验，同时无法考虑变量之间的交互作用。Box-Behnken设计响应面法是一种用于多变量建模和优化的数学统计方法，能够综合评价一组变量与响应值(因变量)的关系，可用于优化提取条件。本试验采用乙醇作为提取溶剂，利用超声空化作用、热作用、机械搅拌、扩散、乳化和机械粉碎等优势，采用Box-Behnken设计，以提取得到的α-酸和β-酸的含量为评价指标，探究超声提取工艺的最佳条件，为啤酒花提取加工企业提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验原料

颗粒状啤酒花样品由新疆某啤酒花有限公司提供。

1.2 主要试剂

甲醇(分析纯，天津康科德科技有限公司)、乙醇(分析纯、潍坊铭阳实验分析仪器有限公司)、氢氧化钠饱和溶液、蒸馏水等。

1.3 主要仪器

Multiskan Go分光光度计(金业德祥生物科技有限公司)、METVX200-T振荡器(施锐贸易有限公司)、FRQ-1004T超声波清洗机(苏州力翰威自动化设备有限公司)、ZN-02型粉碎机(兴时立和科技发展有限公司)等。

1.4 α-酸和β-酸含量检测方法

啤酒花中的活性成分主要为α-酸(葎草酮类)和β-酸(蛇麻酮类)，其中α-酸主要为葎草酮、合葎草酮和加葎草酮，β-酸主要为蛇麻酮、合蛇麻酮和加蛇麻酮[5]。

啤酒花α-酸、β-酸含量的检测方法参照GB/T 20639—2006。准确称取混合均匀的啤酒花样品1.000 0 g，放入烧杯中，加入20.0 mL乙醇，放入超声波清洗机中进行超声提取，精确移取0.5 mL上清液放入10 mL的容量瓶中，用甲醇定容，此为A液。再移取A液0.6 mL放入10 mL的容量瓶中，用碱性甲醇(100 mL的甲醇中加入6 mol/L的NaOH 0.2 mL)定容，此为B液。分别在波长275、325及355 nm下测定B液的吸光度值，α-酸和β-酸含量的计算公式为：

α-酸含量(%)=0.666 7×[-(51.56×A355)+(73.79×A325)-(19.07×A275)];β-酸含量(%)=0.666 7×[-(55.57×A355)-(47.59×A325)+(5.10×A275)]。

式中：A355、A325、A275分别为B液在波长355、325、275 nm下的吸光度值，其余数据均为公式中的经验值。

1.5 试验单因素设定范围

本试验以乙醇为溶剂，超声清洗机频率为49 Hz，经前期摸索，料液比分别设为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 (g∶mL)；提取温度分别设为20、30、40、50、60 ℃；提取时间分别设为10、20、30、40、50 min。单因素试验每个试验点重复4次。

1.6 Box-Behnken响应面试验

根据单因素试验结果，利用Design Expert软件，以料液比、提取时间、提取温度3个因素为自变量，提取液中α-酸和β-酸含量为响应值，按照3因素3水平进行Box-Behnken响应面试验，确定啤酒花超声提取的最佳工艺条件。

1.7 数据处理与分析

采用SPSS 18.0对试验结果进行均值差异显著性检验，显著标准为P<0.05。采用Design-Expert 10.0.4对试验结果进行分析，建立以α-酸和β-酸含量为响应值的复合评价体系，设计3因素3水平的二次回归方程，拟合自变量与响应值的函数关系。将得到的2个回归方程联立共解，以获得同时满足α-酸、β-酸提取的最佳条件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对超声提取啤酒花中α-酸和β-酸含量的影响

不同料液比对α-酸和β-酸含量的影响见图1。提取液中α-酸和β-酸含量随料液比的增加呈先升高后降低趋势。料液比为1∶25时α-酸和β-酸含量显著高于料液比为1∶10、1∶15及1∶30时(P<0.05)，与料液比为1∶20时差异不显著(P>0.05)。根据上述结果，选择料液比1∶25作为响应面的中心点。

数据点标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下图同。Data points with different small letters mean significant difference (P<0.05).The same as below.图1 料液比对α-酸和β-酸含量的影响Fig.1 Effects of solid-liquid ratio on α-acid and β-acid contents

2.1.2 提取温度对超声提取啤酒花中α-酸和β-酸含量的影响

不同提取温度对α-酸和β-酸含量的影响见图2。提取液中α-酸和β-酸含量随提取温度的升高先升高后降低。提取温度为20 ℃时α-酸含量显著低于其余4个提取温度(P<0.05)；提取温度为40 ℃时β-酸含量显著高于20 ℃时(P<0.05)。根据上述结果可知，α-酸和β-酸的提取率随提取温度的升高呈先升高后降低趋势，30～60 ℃时虽差异不显著(P>0.05)，但以40 ℃为中点，因此选择提取温度40 ℃作为响应面的中心点。

图2 提取温度对α-酸和β-酸含量的影响Fig.2 Effects of extraction temperature on α-acid and β-acid contents

2.1.3 提取时间对超声提取啤酒花中α-酸和β-酸含量的影响

不同提取时间对α-酸和β-酸含量的影响见图3。提取液中α-酸和β-酸含量随提取时间的延长呈升高趋势。提取时间为40 min时α-酸含量显著高于提取时间为10和20 min时(P<0.05)，与提取时间为30、50 min时无显著差异(P>0.05)；提取时间为40 min时β-酸含量显著高于提取时间为10 min时(P<0.05)，与其余提取时间无显著差异(P>0.05)。α-酸和β-酸的提取率随提取时间的延长呈先升高后稳定的趋势，30～50 min时虽差异不显著，但以40 min为中点，因此选择提取时间40 min作为响应面的中心点。

2.2 Box-Behnken响应面试验

根据单因素试验结果，设定Box-Behnken响应面试验的因素和水平，详见表1。Box-Behnken响应面试验结果见表2。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and their levels used in response surface test

表2 响应面试验结果Table 2 Experimental results of response surface test

利用Design Expert10.0.4软件进行回归模型方差分析和显著性检验，分别得到α-酸(Y1)和β-酸含量(Y2)与3个因素料液比(A)、提取时间(B)、提取温度(C)的三元二次多项式回归方程：

Y1=54.46-10.97×A+5.77×B+6.62×C-0.51×AB-8.44×AC+2.83×BC-16.47×A2-20.44×B2-10.61×C2；Y2=48.74-7.68×A+3.59×B+3.56×C-0.72×AB-4.59×AC+1.12×BC-14.59×A2-16.78×B2-11.93×C2。

由表3和表4可以看出，2个回归模型都达到了极显著水平(P<0.01)，决定系数(R2)分别为0.945 9和0.964 2，同时失拟检验不显著(P>0.05)，说明模型与实际结果拟合良好。

表3 α-酸含量作为响应值的回归模型方差分析Table 3 ANOVA for regression model with α-acid content as response value

表4 β-酸含量作为响应值的回归模型方差分析Table 4 ANOVA for regression model with β-acid content as response value

2.3 响应面试验中各个因素的交互作用分析

利用Design Expert 10.0.4软件，根据得到的回归方程，对表3和表4的数据进行多元回归拟合，绘制不同的影响因素对响应值的三维曲线图，响应面的陡峭程度表明各个自变量对于α-酸和β-酸含量的影响情况。等高线的密集程度可表示因素的变化对α-酸和β-酸含量的影响程度[15-16]。

由图4及表3可知，在等高线的中心区域，α-酸含量最高，由中心向边缘逐渐降低。在3个因素中，料液比对α-酸含量的影响极显著(P<0.01)，提取时间对α-酸含量的影响显著(P<0.05)，提取温度对α-酸含量的影响显著(P<0.05)，料液比和温度的交互作用对α-酸含量的影响显著(P<0.05)。等高线密集程度及响应面的陡峭程度表明，料液比对α-酸含量的影响最大，其次是提取温度及提取时间。

图4 各因素对α-酸含量影响的响应面图Fig.4 Response surface graphs for effects of various factors on α-acid content

由图5及表4可知，在等高线的中心区域，β-酸含量最高，由中心向边缘逐渐降低。3个因素中，料液比对β-酸含量的影响极显著(P<0.01)，提取时间及提取温度对β-酸含量的影响呈弱显著性(P=0.058 2、P=0.059 8)，提取温度和提取时间的交互作用显著影响β-酸含量(P<0.05)。等高线密集程度及响应面的陡峭程度表明，对β-酸含量影响最大的是料液比，其次是提取时间及提取温度。

图5 各因素对β-酸含量影响的响应面图Fig.5 Response surface graphs for effects of various factors on β-acid content

将2个回归方程联立求解，对各自变量求导，得到α-酸和β-酸的最佳提取条件：即料液比1∶10，提取时间50 min，提取温度54 ℃，此时回归模型预测α-酸含量为51.16%，β-酸含量为43.16%。

为验证试验结果的可靠性，用试验得到的最佳提取条件对啤酒花中的α-酸和β-酸进行超声提取，共重复3次作为平行试验，测定α-酸和β-酸含量，取平均值，最终得到的实测结果α-酸含量为50.89%，β-酸含量为42.93%。实测值与预测值接近，吻合良好，模型准确可靠，能较好地预测啤酒花实际提取中α-酸和β-酸的提取情况。

3 讨 论

3.1 料液比对超声提取啤酒花中α-酸和β-酸含量的影响

料液比是直接影响物质与溶剂间扩散效率的重要因素之一，在料液比较小或处于某一范围内时，提取率随料液比的增大而增大，溶剂析出效应占主导[17]，但当物质与溶剂间的扩散达到了平衡状态时，料液比增大将会出现提取率下降趋势[15,18]。连文绮[14]研究微波提取啤酒花中α-酸和β-酸时发现，料液比过小，萃取不完全，料液比过大，造成萃取溶剂浪费及后期加工费用提升等问题。此外，料液比与溶液黏稠度相关，料液比较低时，溶液黏稠，有效成分溶解不够充分，不利于超声提取，当料液比增加时，多糖分子易于溶出，提取率增大[19]。在本试验中，改变料液比，α-酸和β-酸含量随料液比增加而呈现出先上升后下降的趋势。在料液比由1∶10增加至1∶25时，α-酸和β-酸含量逐渐上升，原因可能是料液比较小时，溶液的黏度较大，分子扩散速度低，提取率小，随着料液比的继续增加，溶液中α-酸和β-酸的含量降低，使更多的α-酸和β-酸从啤酒花中释放出来，提高提取率。当料液比进一步提升时，α-酸和β-酸从啤酒花中释放出来的增加量小于溶剂添加量，溶质被进一步稀释，因此α-酸和β-酸的含量又呈现出下降的趋势。

3.2 提取温度对超声提取啤酒花中α-酸和β-酸含量的影响

温度升高能够加快分子运动速度和分子渗透扩散能力，加快物质溶出率，提高提取率[20]。冷进松等[21]研究啤酒花精油超声辅助水酶法提取工艺，研究发现最适提取温度为50 ℃。王亚南[22]提取啤酒花中总黄酮，最适提取温度为52 ℃，超声负压连续提取有效减少提取过程中活性成分损失。在本试验中，α-酸和β-酸含量随提取温度的升高而呈现出先上升后下降的趋势，提取温度升高，啤酒花内部的分子热运动加剧，更有利于α-酸和β-酸的析出，提取液中α-酸和β-酸的含量升高，提取率增加，但是提取温度继续升高，超过40 ℃后会对啤酒花分子造成一定程度的破坏，从而导致提取率降低。夏娜[23]研究发现，温度越高，啤酒花中α-酸和β-酸提取率变化幅度变大，损失率升高，与本试验研究结果一致。

3.3 提取时间对超声提取啤酒花中α-酸和β-酸含量的影响

超声具有空化作用、热作用、机械搅拌、扩散、乳化和机械粉碎等优势，一定范围内，延长提取时间可提升提取率[24-25]。孙世琨[26]探究啤酒花中黄酮类物质的提取，发现超声最佳提取条件为：乙醇溶液浓度60%，提取时间15 min，料液比1∶30(g∶mL)。在本试验中，提取液中α-酸和β-酸含量均随提取时间的延长而呈现出上升的趋势，但到40 min后α-酸和β-酸含量会逐渐变得平稳，无明显下降，超声时间的延长对其提取率的改变已无明显作用。与前人研究结果不同的原因在于，本试验采用超声提取，以乙醇作为提取溶剂，从提取率来看，本试验采用超声提取的提取率优于微波提取[23,26]。

3.4 本试验α-酸和β-酸提取率与前人结果对比分析

提取方式不同，啤酒花中α-酸和β-酸的提取率有所差异。艾娜丝等[7]探究超临界CO2萃取“青岛大花”啤酒花精油的最适工艺参数，以干制啤酒花为原料，以萃取压力、萃取温度、萃取时间为试验因子，采用正交试验设计筛选最佳工艺参数，啤酒花精油的得油率为5.3%，主要成分为月桂烯(40.37%)、α-律草烯(9.12%)、反式石竹烯(4.67%)。白璐[9]采用响应面法建立乙醇浓度、料液比、微波时间3个因素与α-酸含量之间的数学模型，确定啤酒花的最优提取工艺条件为：乙醇浓度70.74%，料液比1∶20.93，微波时间79.62 s。在此条件下，α-酸含量可达14.02%。连文绮[14]通过单因素试验和正交试验优化微波辅助萃取α-酸、β-酸的最佳工艺参数，最佳条件下α-酸含量(质量分数)为43.65%，β-酸含量(质量分数)为35.03%。本试验采用超声提取，最佳提取条件下，α-酸含量为50.89%，β-酸含量为42.93%。与前人研究结果不同的原因在于，超声提取与微波提取方式不同，但α-酸含量均呈现高于β-酸含量的趋势。

4 结 论

利用响应面法优化超声提取条件后可有效提高啤酒花中α-酸和β-酸的提取率，与本文中单因素试验结果相比，α-酸提取率提高约20%，β-酸提取率提高约16%。优化后啤酒花中α-酸和β-酸的最佳提取条件为：料液比1∶10、提取温度54 ℃、提取时间50 min。