不同发酵乳酸菌剂及组合添加对甜高粱青贮营养价值、微生物数量及有氧稳定性的影响

付 薇 陈 伟 王小利 孟军江 覃涛英 韩永芬*

(1.贵州省草业研究所，贵阳 550006；2.贵州金农富平生态农牧科技有限公司，松桃 554100)

甜高粱(sweet sorghum)是禾本科一年生碳四植物，光和效率高，鲜草产量高达225 000～300 000 kg/hm2，茎秆含糖锤度多在13%～20%，是青贮的优质饲草原料。通过青贮发酵，其粗蛋白质(CP)含量与青贮玉米相当或优于青贮玉米[1]，干物质(DM)降解率、中性洗涤纤维(NDF)消化率在牛、羊体内高于青贮玉米，pH、乳酸含量与青贮玉米相近[2]。甜高粱在夏季生长旺盛，鲜草往往过剩，南方气候多雨湿润，不宜干草加工，对其进行青贮调制不仅可以最大程度保留营养成分，还可有效解决南方草料季节性供应不均衡问题。

研究表明，禾本科饲草自然状态下叶片周围附着乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)数量较少，酵母菌、霉菌等不利于青贮发酵的微生物较多，适量添加乳酸菌主导青贮发酵，对加速青贮进程、提高青贮营养品质有积极的促进作用[3-4]。乳酸菌主要分为2类，一类是同型发酵乳酸菌，主要包括植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、蒙氏肠球菌(Enterococcusmundtti)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosus)、酪蛋白乳杆菌(Lactobacilluscasein)等，同型发酵乳酸菌具有较快的发酵特性，能有效降低乙醇和氨态氮含量，减少青贮营养损失，较好地保存青绿饲料的营养价值[5-6]，但对青贮开窖后有氧腐败抑制效果不显著[7]；另一类为异型发酵乳酸菌，包括布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、短乳杆菌(Lactobacillusbreris)、希氏乳杆菌(Lactobacillushilgardii)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)等，Polukis等[8]、Rabelo等[9]研究指出，异型发酵乳酸菌对青贮发酵过程影响不大，但在青贮过程中能产生大量抑制真菌生长的乙酸，对提高青贮有氧稳定性、保存饲料营养价值有促进作用。

单一的乳酸菌添加模式已无法同时兼顾青贮发酵品质与有氧暴露后腐败抑制的要求，同型/异型乳酸菌混合添加对青贮发酵效果的影响逐步成为青贮菌剂研究的热点[10-12]。目前，国内外异型发酵乳酸菌的研究主要集中在布氏乳杆菌[13-15]，其他异型发酵乳酸菌与同型发酵乳酸菌的协同效果如何？对青贮有氧暴露前后营养价值与微生物变化规律有何影响？国内尚乏深入研究[16-17]。因此，本研究以贵州省草业研究所前期从禾本科牧草中获得的异型发酵乳酸菌为材料，通过产酸、生长速率测定，从中筛选pH降低快、产酸效率高的异型发酵乳酸菌进行同型/异型乳酸菌混合青贮，旨在明确不同发酵乳酸菌剂及组合添加对甜高粱青贮营养价值、微生物数量及有氧稳定性的影响，为异型发酵乳酸菌筛选利用和甜高粱青贮复合菌剂的开发研制提供科学依据与技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

青贮原料：大力士甜高粱，于2018年4月10日播种于贵州省草业研究所松桃县高产饲草基地，种植面积1 hm2，种植行距为60 m×20 m，2018年8月3日蜡熟初期收割。

试验菌种：贵州省草业研究所前期分离获得的1株植物乳杆菌LP06，1株戊糖片球菌PP02，3株短乳杆菌LBR02、LBR07、LBR10和2株发酵乳杆菌LFE13、LFE19，以上菌株分别记为LP06、PP02、LBR02、LBR07、LBR10、LFE13、LFE19。

1.2 试验方法

1.2.1 乳酸菌生长活性和产酸特性测定

分别取1环异型发酵乳酸菌(LBR02、LBR07、LBR10、LFE13、LFE19)转入5 mL MRS液体培养基中，置于37 ℃恒温培养箱中，期间测定4、8、12、16、20、24 h各菌株培养液的pH和620 nm吸光度(OD620)，重复测定3次。

1.2.2 甜高粱青贮制作

将甜高粱晾晒至水分含量在60%～70%，切碎至3～5 cm长度，装入聚乙烯袋(塑料袋规格为600 mm×500 mm)。根据菌株筛选结果，设计8个菌剂添加处理：1)CK处理(无乳酸菌)；2)T处理(LP06∶PP02=1∶1)；3)Y1处理(LBR02)；4)Y2处理(LBR07)；5)Y3处理(LFE19)；6)T+Y1处理(LP06∶PP02∶LBR02=1∶1∶2)；7)T+Y2处理(LP06∶PP02∶LBR07=1∶1∶2)；8)T+Y3处理(LP06∶PP02∶LFE19=1∶1∶2)。每个处理3个重复，菌剂添加量均为5×105CFU/g。将制备好的菌剂按10 mL/kg鲜草添加量喷洒至青贮原料表面充分混匀，压实，密封，青贮60 d。

1.3 指标测定

在青贮第60天测定甜高粱青贮的pH、营养成分含量及微生物数量。营养成分包括DM、CP、可溶性碳水化合物(WSC)、酸性洗涤纤维(ADF)、中性洗涤纤维。微生物包括乳酸菌、酵母菌和霉菌。在有氧暴露后第0、3、6、9天测定甜高粱青贮的pH，DM、WSC含量，有氧稳定性以及乳酸菌、酵母菌和霉菌数量。

1.4 测定方法

pH及营养成分：pH采用酸度计(PHS-25)测定；DM、CP含量参照AOAC(2005)[18]方法测定，其中DM含量采用烘干重量法测定，CP含量采用凯氏定氮法测定；WSC含量采用蒽酮-硫酸比色法测定[19]，ADF和NDF含量采用范氏洗涤纤维法测定[20]。

乳酸菌、酵母菌和霉菌数量：称取20 g样品于180 mL无菌生理盐水中，4 ℃下振荡1 h后制备系列梯度稀释液(101～107)[21]。各微生物均采用菌落计数法计数，在MRS固体培养基上涂布稀释液，于37 ℃下恒温厌氧培养72 h，统计乳酸菌数量。在马铃薯葡萄糖培养基上涂布稀释液，于25 ℃下恒温有氧培养72 h，统计酵母菌数量。在马丁培养基上涂布稀释液，于25 ℃下恒温有氧培养72 h，统计霉菌数量。数据换算为以10为底的对数。

有氧稳定性：有氧稳定性主要观测青贮样品有氧暴露后的温度变化，样品几何中心温度超过环境温度2 ℃所用时长即为有氧稳定性。

1.5 数据统计

使用Excel 2007软件对基础数据进行整理，采用SPSS 18.0统计软件进行单因子方差分析，并用Duncan氏法进行组间差异显著性分析，P<0.05代表差异显著，P<0.01代表差异极显著。采用模糊数学隶属函数法[22]对8个处理青贮60 d和有氧暴露第9天的10个测定指标进行综合评价，计算公式如下：

Uxi(+)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)；Uxi(-)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)。

式中：Uxi(+)为各指标正相关隶属函数值；Uxi(-)为各指标负相关隶属函数值；Xi为某指标测定值；Xmin和Xmax分别为某指标所有测定值中的最小值和最大值。以全部指标隶属函数值平均值大小进行排名。

2 结果与分析

2.1 异型发酵乳酸菌生长活性和产酸特性

由图1所示，LBR02在14 h时进入对数生长期，22 h后OD620稳定在2.1左右。LBR07在12 h时进入对数生长期，20 h后OD620稳定在1.9左右。LFE19的对数生长期为12～18 h，20 h稳定后OD620稳定在1.7左右。LBR02、LBR07、LFE19在生长22 h后，生长活性明显强于另外2株菌株。

图1 5株异型发酵乳酸菌生长活性Fig.1 Growth activity of 5 heterofermentative lactic acid bacteria

由图2所示，LBR02、LBR07、LFE19前期pH下降缓慢，进入各自对数生长期后pH快速下降，24 h时5株菌株的pH从低到高依次排序为：LBR02

图2 5株异型发酵乳酸菌产酸特性Fig.2 Acid production characteristics of 5 heterofermentative lactic acid bacteria

2.2 不同发酵乳酸菌剂及组合添加对甜高粱青贮60 d后pH、营养价值及主要微生物的影响

如表1所示，青贮前(初始发酵)，甜高粱pH为5.62，DM含量为25.75%，CP含量为6.52%，WSC含量为10.20%，NDF含量为40.47%，ADF含量为30.55%。与青贮前相比，青贮60 d后，各处理pH均显著降低(P<0.05)，各处理之间差异不显著(P>0.05)；各处理DM含量有所下降，但差异不显著(P>0.05)；各处理CP含量均显著降低(P<0.05)，其中T处理CP含量下降幅度最小，CK处理CP含量下降幅度最大；各处理WSC含量均显著降低(P<0.05)，其中CK、Y3、T+Y3处理WSC含量显著高于其他处理(P<0.05)，CK处理WSC含量下降幅度最小(60.39%)，T+Y2处理WSC含量下降幅度最大(70.39%)。青贮前后甜高粱ADF和NDF含量没有显著差异(P>0.05)。

表1 不同发酵乳酸菌剂及组合添加对甜高粱青贮60 d后pH、营养价值及主要微生物数量的影响Table 1 Effects of different lactic acid bacteria agents and their combinations on pH,nutritional value and major microorganisms number of sweet sorghum after 60 days silage

青贮前，甜高粱乳酸菌数量为4.06 lg(CFU/g FM)。与青贮前相比，青贮60 d后，各处理乳酸菌数量显著提高(P<0.05)，其中T处理乳酸菌数量最高，其次为T+Y1、T+Y2处理，3个处理乳酸菌数量均大于8.20 lg(CFU/g FM)，且CK处理乳酸菌数量显著低于其他处理(P<0.05)；各处理酵母菌和霉菌数量显著降低(P<0.05)，其中Y1处理霉菌抑制效果最佳，未检测出霉菌。

2.3 不同发酵乳酸菌剂及组合添加对甜高粱青贮有氧暴露后pH、营养价值和有氧稳定性的影响

如表2所示，有氧暴露第3天，各处理pH稳定在4.3以下；有氧暴露第6天，CK、T和T+Y3处理pH出现了较大幅度上升；有氧暴露第9天，Y1、Y2、T+Y1、T+Y2处理pH显著低于其他处理(P<0.05)，pH大小依次为：Y2处理

表2 不同发酵乳酸菌剂及组合添加对甜高粱青贮有氧暴露后pH、营养价值和有氧稳定性的影响Table 2 Effects of different lactic acid bacteria agents and their combinations on pH,nutritional value and aerobic stability of sweet sorghum silage after aerobic exposure

续表2项目Items有氧暴露时间Aerobicexposuretime/d处理TreatmentCKTY1Y2Y3T+Y1T+Y2T+Y3P值P-value可溶性碳水化合物WSC/%DM04.04±0.34a3.28±0.25b3.19±0.46b3.14±0.09b3.85±0.13a3.23±0.03b3.02±0.17b3.88±0.59a<0.00134.00±0.03a2.95±0.05d3.19±0.12c2.97±0.14d3.40±0.26b2.98±0.03d2.82±0.31e2.95±0.08d<0.00162.96±0.21a2.28±0.03e2.84±0.18b2.59±0.11c2.48±0.25d2.49±0.02d2.32±0.09e2.10±0.10f<0.00191.76±0.17d1.40±0.22f2.10±0.10b2.20±0.06a1.79±0.03d2.04±0.15b1.94±0.03c1.68±0.12e<0.001有氧稳定性Aerobicstability/h104.92±2.46g102.52±5.21g183.45±3.39a159.04±3.24c131.25±8.07e172.18±2.59b148.71±2.95d115.47±8.00f<0.001

2.4 不同发酵乳酸菌剂及组合添加对甜高粱青贮有氧暴露后主要微生物数量的影响

如表3所示，有氧暴露第3天和第6天，各处理乳酸菌数量变化不大；有氧暴露第9天，各处理乳酸菌数量出现不同程度降低，Y1、Y3、T+Y1处理乳酸菌数量显著高于其他处理(P<0.05)，乳酸菌数量依次为：Y1处理>Y3处理>T+Y1处理>Y2处理>T+Y3处理>T+Y2处理>T处理>CK处理。有氧暴露后，各处理酵母菌数量不同程度增加；有氧暴露第9天，Y1、Y2、T+Y1、T+Y2处理酵母菌数量显著低于其他处理(P<0.05)，其中以Y1、T+Y1处理酵母菌数量较低。整个有氧暴露阶段，Y1处理霉菌抑制效果较好，有氧暴露至第6天均未检测出霉菌，Y2、T+Y1、T+Y2处理霉菌抑制效果其次；有氧暴露第9天，Y1、Y2、T+Y1、T+Y2处理霉菌数量显著低于其他处理(P<0.05)。

表3 不同发酵乳酸菌剂及组合添加对甜高粱青贮有氧暴露后主要微生物数量的影响Table 3 Effects of different lactic acid bacteria agents and their combinations on major microorganisms number of sweet sorghum silage after aerobic exposure lg(CFU/g FM)

2.5 不同发酵乳酸菌剂及组合添加对甜高粱青贮营养价值、主要微生物数量及有氧稳定性影响的综合评价

如表4所示，为评价不同发酵乳酸菌剂及组合添加对甜高粱青贮营养价值、微生物数量及有氧稳定性的综合效果，本研究利用隶属函数法对8个处理青贮60 d和有氧暴露9 d的10个指标进行综合评价，其中DM、CP、WSC含量和乳酸菌数量以及有氧稳定性为5个正向指标，pH和NDF、ADF含量以及酵母菌、霉菌数量为5个负向指标。根据5个正向指标和5个负向指标的平均隶属函数值对8个处理进行综合评定，平均值越高表明该处理综合应用价值越高，从高到低依次为：T+Y1处理(0.64)>Y1处理(0.59)>T+Y2处理(0.58)>Y2处理(0.52)>Y3处理(0.45)>T处理(0.42)>T+Y3处理(0.37)>CK处理(0.31)。

表4 不同发酵乳酸菌剂及组合添加对甜高粱青贮营养价值、主要微生物数量及有氧稳定性影响的综合评价Table 4 Comprehensive evaluation of effects of different lactic acid bacteria agents and their combinations on nutritional value,major microorganisms number and aerobic stability of sweet sorghum silage

3 讨 论

3.1 优良异型青贮乳酸菌的筛选及同型/异型发酵乳酸菌剂组合的构建

生长活力强、产酸速率高是优良乳酸菌筛选的重要特征。从生长活力上看，LBR02、LBR07和LFE19分别在14和12 h时即可进入对数生长期，20 h左右OD620分别稳定至2.1、1.9和1.7，生长快速，活力较强，这与魏日华[23]对布氏乳杆菌生长活力的研究结果相似。从产酸速率上看，pH快速下降至4.2以下，能够有效抑制青贮底物中酵母菌、霉菌等有害微生物繁殖，提高发酵成功率。LBR02、LBR07和LFE19的pH分别在22、20和18 h时即可下降至4.2以下，产酸速率较高。根据LBR02、LBR07和LFE19的生长活力和产酸速率特征，初步判定其适合作为青贮添加菌剂试验。但并非所有菌种都适用于任何一种情况下的青贮添加，受发酵底物品种、菌种类别、菌系协同作用等多种因素影响，不同菌剂添加的青贮发酵效果均有所差异[24-25]。因此，本研究以这3株异型发酵乳酸菌和前期筛选获得的2株同型发酵乳酸菌构建同型/异型发酵乳酸菌剂组合，进一步探讨不同菌剂添加对甜高粱青贮发酵及有氧腐败抑制效果的影响。

3.2 不同发酵乳酸菌剂及组合添加对甜高粱青贮pH、营养价值及主要微生物数量的影响

青饲草通过青贮发酵能够快速降低pH，减少损耗，保存饲料营养，一般认为pH在3.8～4.2的青贮饲料品质较好。本研究中，8个处理发酵60 d后pH均低于4.2，其中T处理表现最优，T处理为同型发酵乳酸菌，这与贾婷婷等[7]研究结论相一致，进一步表明在青贮中加入同型发酵乳酸菌更有利于加快青贮进程。营养成分是评价青贮发酵品质的重要指标，一般认为青贮后DM、CP、WSC含量越高，青贮品质越好。青贮60 d后，8个处理DM含量均有所降低，T、T+Y1、T+Y2处理DM含量略高于其他处理，原因可能是这3个处理菌株生长相对较快，青贮快速酸化，抑制了有害细菌生长，减少了DM损失，这一结果与pH测定结果较吻合。青贮60 d后，各处理CP含量较青贮前显著下降，其原因可能与甜高粱青贮后的呼吸作用、蛋白质降解酶和相关微生物代谢活动有关[26]，7个添加乳酸菌处理的CP含量均显著高于未添加乳酸菌的CK处理，表明同型、异型和同型/异型复合发酵处理均能较好抑制甜高粱蛋白质降解。青贮发酵时微生物需要能量来源以保证自身生长，WSC作为乳酸菌生长碳源摄取的主要底物，在青贮过程中被乳酸菌代谢消化，其含量可以间接反映乳酸菌生长情况。本试验中，Y3、T+Y3和CK处理青贮60 d后WSC含量显著高于其他处理，可能与这3个处理乳酸菌代谢活动相对较弱、WSC分解消耗较慢有关。ADF和NDF是动物饲料精粗比平衡与否的重要评定指标，其通过影响反刍动物的咀嚼时间、唾液分泌量等，间接影响动物的消化率，二者含量越高，可供家畜吸收利用的营养成分反之越少[27]。本研究中，与青贮前相比，青贮60 d后8个处理ADF、NDF含量变化并不显著，这与紫花苜蓿和甜高粱混合青贮后消化率显著增加的结论[28]不一致，可能原因是本次试验所用底物或乳酸菌种类酶含量较少、酶活性较弱，在提高消化率上作用不显著，具体原因还需继续探索。

刘晗璐[29]研究指出，新鲜牧草附着的微生物以一般细菌、酵母菌和霉菌为主，想要获取发酵品质较好的青贮饲料，乳酸菌数量一般需高于5 lg(CFU/g FM)。本研究中，青贮60 d后，8个处理乳酸菌数量大幅增加至7 lg(CFU/g FM)以上，酵母菌和霉菌生长得到有效抑制，其中同型发酵乳酸菌T处理和同型/异型发酵乳酸菌T+Y1、T+Y2、T+Y3处理乳酸菌数量大于8 lg(CFU/g FM)，显著高于乳酸菌未添加处理和其他3组异型发酵乳酸菌单独添加处理。Filya[30]在玉米和高粱青贮饲料的研究中指出，不同配比乳酸菌增殖程度不一致，一般同型发酵乳酸菌增殖速度高于异型发酵乳酸菌，本研究结果与Filya[30]报道一致。

3.3 不同发酵乳酸菌剂及组合添加对甜高粱青贮有氧腐败抑制效果的影响

有氧稳定性是指青贮饲料在有氧暴露后随着pH、温度升高依然保持新鲜、气味酸香的持续时间[14]。对青贮玉米的研究指出，实际生产中青贮有氧暴露后接触到空气的部分有氧稳定性不会超过5 d[4,22]。本研究中，LBR02单独添加或与LP06、PP02复合添加，相对于T处理有氧稳定性显著增加，其中Y1和T+Y1处理有氧稳定性分别达183.45和172.18 h，比T处理多出80.92和69.66 h。在以黑麦草、扁穗牛鞭草为青贮原料的试验研究也表明，尽管同型发酵乳酸菌可有效降低青贮过程中的营养损耗，但对增加有氧稳定性没有明显优势[31-32]。

青贮有氧暴露后，pH和DM、WSC含量以及乳酸菌、好氧菌的生长情况等多种因素变化均能反映青贮饲料有氧腐败程度。本研究中，有氧暴露后，青贮有氧稳定性减弱，Y1、Y2、T+Y1处理的DM含量表现为先上升后下降，可能是这3个处理有氧腐败和物质损耗相对较少，DM含量因青贮渗出液的流失短暂增加所致。Huisden等[33]研究指出，青贮残余过多的WSC可供好氧微生物分解利用，也不利于青贮饲料有氧暴露后的品质稳定。本研究中，青贮60 d时WSC含量较高的T、Y3、T+Y3处理，随着有氧暴露时间延长，WSC含量迅速下降，有氧暴露第9天的WSC含量下降幅度分别高达57.41%、53.55%、56.70%，显著低于Y1、Y2、T+Y1、T+Y2处理，这与Huisden等[33]的研究结论相吻合。青贮有氧暴露后，酵母菌和霉菌等有害微生物不断利用营养物质大量增殖，逐步引起青贮饲料腐败变质[34]。本研究中，有氧暴露第9天，Y1、Y2、T+Y1、T+Y2处理酵母菌和霉菌数量显著低于其他处理，其中Y1处理有氧暴露第0、3、6天未检测出霉菌存在，4个处理对酵母菌和霉菌的抑制表现同pH动态变化较为一致，整个有氧暴露阶段，Y1、Y2、T+Y1、T+Y2处理的pH上升缓慢，有氧暴露第9天，当T处理的pH升高至5.5时，这4个处理的pH稳定在4.8以下，显著低于其他处理。对此推测，该结果很可能是由于短乳杆菌异型发酵产生了乙酸等有助提高青贮有氧稳定性的有机酸，尽管这些有机酸对改善青贮发酵品质作用不显著，但对有氧暴露后有害微生物生长抑制和酸性环境维持上作用明显有关[7,29]，具体作用机制还需要进一步探索。

目前对于青贮有氧稳定性尚乏国标参考，对于青贮效果的综合评价主要单纯以发酵指标、营养价值指标、饲用指标或采用隶属函数法进行综合评价[12,35]。本研究选取甜高粱青贮60 d和有氧暴露9 d的10个指标对各乳酸菌剂青贮效果进行综合评价，评价结果相对具有全面性，但指标选择较为主观片面，且未考虑权重因素，在后续研究中还应明确各指标在青贮中的重要程度，进而作出更为科学客观的评价。

4 结 论

① 不同发酵乳酸菌剂及组合添加均可不同程度改善甜高粱青贮发酵品质，LBR02单独添加或与LP06、PP02组合添加在在保存甜高粱营养价值、有效抑制酵母菌和霉菌生长、提高青贮有氧稳定性方面作用效果更好。

② 采用隶属函数法进行综合评价，各处理综合价值从高到低依次为：T+Y1处理>Y1处理>T+Y2处理>Y2处理>Y3处理>T处理>T+Y3处理>CK。