EGFR/AKT/CT-1通路对过氧化氢诱导H9C2细胞凋亡的影响

杜娜 贾桂枝 戴红良

(锦州医科大学 1附属第一医院心血管内科，辽宁 锦州 121001；2生理学教研室；3社区护理学教研室)

氧化应激在心力衰竭、心肌缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化、心房纤颤等众多心血管疾病的发病机制中都起着关键性的作用〔1～3〕。氧化应激导致活性氧(ROS)的过度生成，进而引起心肌细胞的明显损伤和凋亡〔4〕。因此，深入了解氧化应激对心肌细胞凋亡的影响及其潜在机制对于进一步揭示心血管疾病的发病机制至关重要。当心肌细胞在受到各种伤害性刺激时，会通过自分泌或旁分泌的形式释放某些促存活细胞因子，发挥自我保护作用〔5〕。研究发现氧化应激在直接诱导心肌细胞凋亡的同时，负反馈性地诱导心肌营养素(CT)-1表达的上调，从而在一定程度上间接缓解了心肌细胞的凋亡〔6〕。本研究探讨氧化应激诱导心肌细胞CT-1表达上调的机制及其对心肌细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器 胰蛋白酶、DMEM培养基、H2O2、AG1478、PP1、GM6001、LY294002(Sigma公司)；胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)；CT-1抗体(美国Abcam公司)；蛋白激酶B(AKT)、磷酸化p-AKT抗体(美国Proteintech公司)；AnnexinV-碘化丙啶(PI)凋亡试剂盒(北京宝赛生物有限公司)；二氧化碳培养箱、酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)、流式细胞仪(美国BD公司)；电泳仪及转膜仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2细胞培养及分组 H9C2大鼠心肌细胞系购自中科院上海细胞库。用含有10% FBS的DMEM，在37℃，5% CO2，饱和湿度下进行常规培养。用200 μmol/L H2O2处理H9C2细胞15～60 min,分别记为H2O215 min组、H2O230 min组、H2O245 min组、H2O260 min组，以不加H2O2处理作为对照组。细胞先以不同抑制剂预处理细胞30 min，随后加入200 μmol/L H2O2继续共处理24 h,分别记为对照组、 H2O2组、AG1478+H2O2组、PP1+H2O2组、LY294002+H2O2组。

1.3蛋白质免疫印迹分析 细胞用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液在冰上充分裂解，得到细胞总蛋白裂解物。将该裂解物于4℃，13 000 r/min下离心5 min，收集上清。用二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白浓度。等量蛋白质采用10%或12%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离并转膜后，依次经封闭、一抗孵育和二抗孵育后，进行电化学发光(ECL)显色。

1.4细胞活力MTT法检测 H9C2细胞经200 μmol/L H2O2处理24 h后，加入终浓度为5 μg/μl的MTT溶液20 μl，于37℃，5% CO2，饱和湿度下进行孵育4 h。弃去培养基，后每孔加入150 μl的二甲基亚砜(DMSO)溶液低速振摇10 min，使结晶充分溶解。最后于490 nm波长处检测吸光度值。

1.5细胞凋亡流式细胞术检测 收集各组细胞用0.25%胰酶消化，1 000 r/min，离心5 min收集细胞，用预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，加入Annexin V-FITC和PI各5 μl，避光室温反应15 min，置于流式细胞仪中检测细胞凋亡情况。

1.6统计学分析 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1H2O2对H9C2细胞AKT磷酸化的影响 对照组、H2O215 min组、H2O230 min组、H2O245 min组、H2O260 min组pAKT水平分别为：1.00±0.00、4.19±0.45、6.54±1.24、5.34±1.13、4.13±0.73，H2O2处理各时间点pAKT水平较对照组均显著增加，30 min时达到峰值。见图1。

2.2GM6001、AG1478、PP1对H2O2诱导AKT磷酸化的影响 对照组、H2O2组、GM6001+H2O2组、AG1478+H2O2组、PP1+H2O2组pAKT表达水平分别为：1.00±0.00、4.24±0.34、4.57±0.44、1.23±0.11、1.07±0.05。H2O2组、GM6001+H2O2组pAKT表达水平显著高于对照组，AG1478+H2O2组、PP1+H2O2组pAKT表达水平显著低于H2O2组(P<0.05)。见图2。

1～5:对照组、H2O2 15 min组、H2O2 30 min组、H2O2 45 min组、H2O2 60 min组图1 H2O2对AKT磷酸化的影响

1～5:对照组、H2O2组、GM6001+H2O2组、AG1478+H2O2组、PP1+H2O2组图2 GM6001、AG1478、PP1对H2O2诱导AKT磷酸化的影响

2.3AG1478、PP1、LY294002对H2O2诱导CT-1上调的影响 对照组、 H2O2组、AG1478+H2O2组、PP1+H2O2组、LY294002+H2O2组CT-1表达水平分别为：1.00±0.00、2.87±0.17、1.24±0.18、1.25±0.03、1.21±0.04。与对照组相比，H2O2组显著促进H9C2细胞CT-1的表达，而AG1478、PP1、LY294002预处理显著阻止氧化剂诱导CT-1水平上调。见图3。

2.4PP1及AG1478对H2O2致H9C2细胞活力降低和凋亡的影响 与对照组相比，H2O2组显著促进H9C2细胞凋亡，降低细胞活力，而PP1和AG1478预处理均进一步增强H2O2的细胞损伤作用。流式细胞检测显示，PP1和AG1478预处理可进一步增加H9C2细胞的凋亡。见表1、图4。

1～5：对照组、H2O2组、AG1478+H2O2组、PP1+H2O2组、LY294002+H2O2 组图3 AG1478、PP1、LY294002对H2O2诱导CT-1上调的影响

表1 PP1 和AG1478对H2O2诱导H9C2细胞活力降低的影响

图4 PP1和AG1478对H2O2诱导H9C2细胞凋亡的影响

3 讨 论

CT-1是白细胞介素-6家族的细胞因子，具有促进心肌肥厚和在应激环境下保护心肌的作用〔7〕。在诸如缺血缺氧、炎症、氧化应激等有害刺激下，外周循环血中及胚胎期或成年心肌细胞中CT-1水平都出现明显升高，以缓解各种应激刺激对心肌细胞的损伤作用〔5〕。H2O2刺激可显著提高心肌细胞内CT-1的水平，从而限制其对心肌细胞的促凋亡效应〔6〕，但目前对于氧化应激促进心肌CT-1上调的分子机理尚缺乏足够了解。有研究证实，在鼠HL-1心肌细胞系或胚胎干细胞中，缺氧可通过激活PI3K/AKT通路诱导CT-1的过表达〔5，8〕。在本研究中，H9C2心肌细胞经H2O2刺激后，AKT出现了迅速和显著的磷酸化。同时，其特异性抑制剂LY294002预处理显著抑制H2O2诱导的CT-1上调。这些数据表明氧化应激对心肌细胞CT-1上调的效应与PI3K/AKT信号通路的活化密切相关。

EGFR是广泛表达于各种类型细胞膜上的一种受体酪氨酸激酶，是属于ErbB受体家族的一个重要成员(其他成员还包括ErbB2、ErbB3、ErbB4)。EGFR与其配体结合后，发生同源或异源二聚化，使其发生自身磷酸化，最终导致酪氨酸激酶活性的激活和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT、磷脂酶(PL)C/蛋白激酶(PK)C等下游信号分子的激活〔9～11〕。例如有研究显示，EGFR介导的氧化应激所致的AKT磷酸化弱化了硼替佐米促肝癌细胞凋亡效应〔12〕。在本研究中我们发现，EGFR特异性抑制剂AG1478显著抑制H2O2诱导的AKT活化，表明H2O2对AKT的活化也是一个EGFR活性依赖的过程。在许多情况下，非受体Src家族酪氨酸激酶与EGFR信号间关系都极为密切。一方面，Src可作用于EGFR的上游，引起EGFR/Tyr845位发生磷酸化，使其激酶结构域稳定在活化状态，从而激活下游的信号分子〔9，13〕；另一方面，Src也可作为EGFR的下游靶点，激活下游的信号分子〔14〕。在本研究中，Src特异性抑制剂PP1和AG1478 (EGFR特异性抑制剂)均可显著抑制H2O2诱导的AKT 磷酸化。表明Src和EGFR很可能在同一信号通路上介导H2O2对AKT的激活。至于在本研究背景下，EGFR和Src之间的上下游关系如何，则尚需进一步确定。虽然在多种刺激和细胞类型中，EGFR的活化依赖于基质金属蛋白酶(MMPs)活性。但在本研究中，MMPs特异性抑制剂未能有效抑制H2O2对AKT的激活，表明H2O2对心肌细胞AKT的磷酸化很可能并不依赖于细胞外基质或细胞表面的EGF样因子的参与。

既然H2O2在心肌细胞上引起AKT活化是由EGFR和Src介导的，这两个分子很可能也像AKT一样参与了H2O2对CT-1的上调作用。的确，AG1478(EGFR抑制剂)和PP1(Src抑制剂)均显著抑制H2O2诱导的CT-1上调。与此类似的是，之前有研究显示在血管平滑肌细胞上也存在EGFR促进CT-1转录上调的现象〔15〕。之前有研究显示AKT信号可在氧化应激状态下发生活化，活化的AKT对氧化应激所致的心肌细胞凋亡起着保护性作用〔16〕。我们最近的研究则显示过氧化氢诱导的CT-1高表达负反馈性地抑制过氧化氢引起的H9C2细胞的凋亡〔6〕。本研究进一步证实PP1和AG1478均显著恶化过氧化氢对H9C2细胞的损伤作用。上述结果表明EGFR/AKT/CT-1信号通路活化在氧化应激损伤状态下对H9C2细胞起着负反馈性的保护作用。

综上所述，氧化应激可通过活化EGFR/AKT/CT-1信号通路，缓解其对H9C2心肌细胞的直接损伤作用，强化该信号通路有可能对氧化应激性心血管疾病产生有益影响。