MicroRNA-129-5p在糖尿病性心肌病中的作用

孔德忆 孔霄

(1韩国嘉泉大学，韩国 首尔 13120；2曲阜市人民医院心内科)

糖尿病性心肌病是糖尿病的主要心血管并发症，其特征是心肌纤维化、心室重构和心脏功能障碍。线粒体功能障碍、氧化应激、炎症、钙处理受损、肾素-血管紧张素系统活化及心肌细胞凋亡均与糖尿病性心肌病的发病机制有关〔1，2〕。微小RNA(miRNAs)是一组由19～25个核苷酸组成的非编码单链RNA，通过对蛋白质编码基因的转录后修饰进行调节，从而抑制miRNA的翻译或促进其降解，进而调节基因表达。研究表明，miRNAs在糖尿病性心肌病的生物学进程中发挥重要作用。miR-206-3p在高糖诱导下表达上调，并通过靶向下调LXRα的表达促进高糖介导的心肌细胞凋亡〔3〕；miR-146可能通过调节IRAK1介导的炎症反应参与糖尿病心肌损伤的发生发展〔4〕。然而，miR-129-5p在糖尿病性心肌病发病中的作用及机制还有待进一步探究。本文旨在探究miR-129-5p在高糖诱导的H9C2心肌细胞中的表达及作用，为糖尿病合并心血管并发症的诊断和治疗提供相关的理论基础。

1 材料与方法

1.1材料 人H9C2心肌细胞购自上海生物科学研究所。主要试剂及仪器：10%胎牛血清(FBS)、DMEM培养基均购自美国Gibco公司。miR-129-5p模拟物及其阴性对照物均购自上海GenePharma公司。Lipofectamine®2000、TRIzol试剂和酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒均购自美国Invitrogen公司。PCR试剂盒和基因引物均购自Takara生物有限公司。CCK-8试剂盒购于爱必信(上海)生物科技有限公司，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购于上海翊圣生物科技有限公司。Ki67、Bax、酶切-caspase-3、β-actin和二抗均购于英国Abcam公司，伯乐流式细胞仪ZE5购于伯乐生命医学产品(上海)有限公司(bio-rad)。多功能酶标仪PerkinElmer EnVision购于珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司 。

1.2细胞培养与转染分组 将H9C2心肌细胞置于含有10% FBS的DMEM培养基中，并在37℃、5% CO2条件下的细胞培养箱中进行培养。取对数生长期的H9C2心肌细胞接种于6孔板中，继续培养24 h。采用5.5 mmol/L葡萄糖(对照组)或50.0 mmol/L葡萄糖(高糖组)干预H9C2心肌细胞96 h。最后，按照制造商的说明，使用脂质体Lipofectamine®2000将miR-129-5p模拟物(HG+miR-129-5p模拟物组)及其阴性对照物(HG+mimics-NC组)转染至H9C2心肌细胞中。

1.3qRT-PCR法检测miR-129-5p的表达水平〔4〕对照组和高糖组干预H9C2心肌细胞不同时间(0、24、48、72、96 h)后，采用实时荧光聚合链式反应(qRT-PCR)检测H9C2心肌细胞中miR-129-5p的相对表达水平。根据制造商说明，使用TRIzol试剂盒提取H9C2心肌细胞中的总RNA，并采用紫外分光光度法检测RNA浓度和纯度，进而合成互补DNA。使用SYBR Premix-Ex-Taq试剂盒进行qRT-PCR反应。以U6为内参，miR-129-5p上游引物：5′-ACACTCCTTTTTGCGTCTGGGCTTGC-3′，下游引物：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6上游引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.4ELISA检测白细胞介素(IL)-1β和肿瘤坏死因子(TNF)-α含量〔5〕采用ELISA检测过表达miR-129-5p对H9C2心肌细胞上清液中炎症细胞因子IL-1β和TNF-α的表达水平。取转染后的H9C2心肌细胞接种于6孔板中，每组设置3个复孔，培养48 h后，收集细胞，于4℃，1 000 r/min离心10 min，取细胞上清液。按照制造商的说明书，应用IL-1β和TNF-α ELISA试剂盒分别检测细胞上清液中IL-1β和TNF-α的含量。

1.5氧化应激标志物超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的测量〔6〕H9C2心肌细胞转染24 h后，按照制造商说明书，应用SOD和MDA试剂盒分别测定H9C2心肌细胞上清液中SOD和MDA的含量。

1.6CCK-8检测各组细胞存活率 收集各组心肌细胞，并接种于96孔板中，接种密度为2×103个细胞/孔，在培养箱中培养48 h后每孔加入CCK-8试剂(10 μl)，继续培养2 h后在酶标仪上于波长为450 nm处检测吸光值。

1.7流式细胞术检测H9C2心肌细胞的凋亡〔7〕采用流式细胞术检测过表达miR-129-5p对H9C2心肌细胞凋亡的影响。细胞转染24 h后，用胰酶消化并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，将H9C2心肌细胞悬浮在100 μl上样缓冲液中，并加入5 μl Annexin V-FITC，然后在黑暗中于室温孵育15 min。随后，添加5 μl PI后，将细胞在室温下黑暗中孵育15 min。最后，按照试剂盒说明书，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.8免疫印迹检测各组细胞中相关蛋白的表达 收集转染后的各组心肌细胞，加入裂解液裂解细胞后提取总蛋白，并对蛋白进行检测，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后进行转膜、封闭，洗膜后分别加入稀释的Ki67(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、酶切-caspase-3(1∶500)和β-actin(1∶1 000)一抗，培养过夜后(4℃)，加入二抗(1∶2 000)，培养2 h后进行显影和拍照。

1.9统计分析方法 采用SPSS25.0软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1两组miR-129-5p表达比较 与对照组相比，高糖组各时点H9C2心肌细胞中miR-129-5p表达显著下调(P<0.05，P<0.01,P<0.001)，且呈时间依赖关系，见表1。

表1 两组不同时间H9C2心肌细胞中miR-129-5p相对表达比较

2.2各组心肌细胞炎症和氧化应激反应比较 与对照组相比，高糖组H9C2心肌细胞中IL-1β、TNF-α和MDA相对含量显著升高(P<0.01)，而SOD相对含量显著降低(P<0.01)；与高糖+mimics-NC组相比，高糖+miR-129-5p模拟物组H9C2心肌细胞中IL-1β、TNF-α和MDA相对含量显著降低(P<0.05,P<0.01)，而SOD相对含量显著升高(P<0.01)，见表2。

表2 各组IL-1β、TNF-α、SOD和MDA相对含量及细胞增殖和凋亡相关蛋白表达比较

2.3各组心肌细胞存活率比较 与对照组〔(100.00±6.78)%〕相比，高糖组H9C2细胞存活率〔(43.42±5.67)%〕显著降低(P<0.001)，与高糖+mimics-NC组〔(46.39±5.11)%〕相比，高糖+miR-129-5p模拟物组中H9C2心肌细胞存活率〔(79.68±8.67)%〕显著增加(P<0.001)。

2.4各组H9C2心肌细胞凋亡比较 与对照组〔(5.71±0.54)%〕相比，高糖组H9C2心肌细胞凋亡率〔(22.56±2.18)%〕显著升高(P<0.001)；与高糖+mimics-NC组〔(19.32±1.86)%〕相比，高糖+miR-129-5p模拟物组中H9C2心肌细胞凋亡率〔(7.27±0.68)%〕显著降低(P<0.001)，见图1。

图1 流式细胞术检测高糖环境下H9C2心肌细胞的凋亡

2.5各组H9C2心肌细胞增殖、凋亡相关蛋白表达比较 与对照组相比，高糖组Ki67蛋白表达量显著降低(P<0.01)，而Bax和酶切-caspase-3蛋白表达显著增加(P<0.01)；与高糖+mimics-NC组相比，高糖+miR-129-5p mimics组Ki67蛋白表达量显著增加(P<0.01)，而Bax和酶切-caspase-3蛋白表达显著减少(P<0.01)。见表2，图2。

1～4：对照组、高糖组、高糖+mimics-NC组、高糖+miR-129-5p mimics组图2 各组细胞增殖和凋亡相关蛋白表达

3 讨 论

糖尿病性心肌病是糖尿病患者的重要心血管并发症，可导致心力衰竭、心律不齐和猝死，是糖尿病患者死亡的主要原因〔8，9〕。然而糖尿病性心肌病的诊断和治疗受到限制。miRNA在许多生物过程中都起重要作用，包括心血管疾病、糖尿病和相关并发症〔10～12〕。有研究发现miR-6216在缺氧/复氧诱导的H9C2心肌细胞中表达上调，敲低miR-6216表达可减轻缺氧/复氧诱导的H9C2心肌细胞损伤〔13〕；姜辉等〔14〕也在研究中发现敲低miR-633可通过调节AKT的活性显著促进缺氧诱导的H9C2心肌细胞增殖和迁移，从而促进心肌梗死进程。研究报道，miR-129-5p在多种疾病中均差异表达，参与调控多个疾病的发生和发展〔15，16〕，然而miR-129-5p在糖尿病性心肌病中的作用还不清楚。

本研究结果证明了miR-129-5p在高糖干预的H9C2心肌细胞中的表达下调。过表达miR-129-5p可在体外减少高糖诱导的H9C2心肌细胞的炎症反应、氧化应激。同时发现过表达miR-129-5p可显著削弱高糖对H9C2心肌细胞的存活率及Ki67蛋白表达水平的抑制作用，另外，流式细胞术分析发现过表达miR-129-5p减轻了高糖诱导的H9C2心肌细胞的凋亡，并减少了高糖诱导的Bax和酶切-caspase-3蛋白表达水平。

综上，在高糖环境下miR-129-5p的表达显著下调，过表达miR-129-5p抑制高糖干预的H9C2心肌细胞的炎症反应、氧化应激及凋亡，并促进了高糖抑制的细胞增殖。提示miR-129-5p具有预防糖尿病心肌病的潜力，并为后续相关研究进一步提供了理论基础。