miR-214-5p通过调控SFRP2影响人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡

林颜 阮树斌 陈晓东 杨荣华 王婧薷 林泽鹏 信琪

(佛山市第一人民医院烧伤整形创面修复外科，广东 佛山 528000)

瘢痕疙瘩形成过程主要涉及瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖活力增强及细胞凋亡能力不断削弱等过程，而皮肤伤害或持续性刺激均可造成瘢痕疙瘩〔1〕。目前关于瘢痕疙瘩发病机制尚未完全阐明，导致瘢痕疙瘩的治疗成为医学难题〔2〕。因此，如何抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖并促使其凋亡成为主要研究领域。研究表明微小RNA-214(miR-214)在瘢痕疙瘩中表达水平显著低于正常皮肤组织，但其具体作用机制尚未见报道〔3〕。已有研究表明微小RNA-214-5p(miR-214-5p)在骨肉瘤和肝癌中均呈下调表达，miR-214-5p过表达可抑制骨肉瘤细胞和肝癌细胞增殖、迁移和侵袭〔4,5〕。但miR-214-5p对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡的影响尚未可知。利用生物信息网站预测miR-214-5p可能调控靶基因，发现分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)2在瘢痕疙瘩中呈高表达〔6,7〕。本研究通过miR-214-5p过表达与沉默SFRP2表达并观察人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及凋亡的变化。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 胎牛血清(FBS)、RPMI1640培养基均购自上海博升生物科技有限公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测试剂盒购自上海泽叶生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒与Annexin V凋亡检测试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；SFRP2抗体购自美国Santa Cruz公司；Trizol、逆转录及实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒均购自大连宝生物科技有限公司；LipofectamineTM2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；miR-214-5p mimic、miR-NC、si-SFRP2、si-NC均购自上海吉玛基因制药技术有限公司；荧光素酶表达载体及双荧光素酶报告基因检测试剂盒均购自美国Progema公司。

1.2方法

1.2.1人瘢痕疙瘩成纤维细胞培养 选取2017年2～10月佛山市第一人民医院收治的10例瘢痕疙瘩患者为研究组，所有患者进行手术切除，于术中切取瘢痕疙瘩组织，置于-80℃超低温冰箱保存。另选取同期佛山市第一人民医院收治的10例非瘢痕疙瘩患者为对照组，于术中切取正常皮肤组织，置于-80℃超低温冰箱保存。术前患者均未接受药物或其他治疗，且患者及家属均知情且签署同意书。取出冻存组织标本，去除结缔组织后置于离心管内，加入胶原酶溶液(含1 g/L的RPMI1640)，离心后置于恒温振荡器内振荡，10 h后弃未消化组织标本，经1 200 r/min转速的离心机离心5 min，弃上清液后加入RPMI640混匀，1 200 r/min转速的离心机离心5 min后弃上清液，然后加入含有10%FBS的RPMI1640培养基，混匀后调整细胞浓度，每隔2 d更换1次培养液，待细胞贴壁生长至80%左右时进行传代培养，分别收集生长良好的瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)与正常皮肤成纤维细胞(NFB)进行后续研究。

1.2.2细胞转染及分组 收集KFB细胞并经胰酶消化后接种于6孔板，依据LipofectamineTM2000转染试剂盒分别将miR-214-5p mimic、miR-NC、si-SFRP2、si-NC转染至KFB细胞，分别为miR-214-5p组、miR-NC组、si-SFRP2组、si-NC组。将pcDNA-SFRP2质粒(miR-214-5p+pcDNA-SFRP2组)、pcDNA质粒(miR-214-5p+pcDNA组)分别与miR-214-5p mimic共同转染至KFB细胞，转染后继续培养48 h，收集细胞进行后续实验。

1.2.3qRT-PCR检测细胞中miR-214-5p、SFRP2 mRNA表达水平 取各组细胞分别加入1 ml Trizol裂解细胞并提取总RNA，应用分光光度计测定RNA浓度与纯度并经凝胶电泳检测条带是否完整，取1 μg RNA进行反转录合成cDNA，miR-214-5p、SFRP2引物均由上海生物工程股份有限公司合成，按照qRT-PCR检测试剂盒说明书配置qRT-PCR反应体系20 μl，ABI 7500 qRT-PCR仪检测miR-214-5p、SFRP2 mRNA相对表达量。

1.2.4Western印迹蛋白表达量 分别收集各组细胞，分别加入RIPA裂解液提取总蛋白，采用BCA法定量蛋白，制备蛋白样品与上样缓冲液混合液，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室温下脱脂奶粉封闭1 h，4℃条件下加入蛋白一抗(1∶1 000)孵育24 h，TBST洗膜，室温下分别加入IgG二抗(1∶3 000)孵育2 h，置于自动凝胶成像系统分析各蛋白条带灰度值。

1.2.5MTT检测细胞增殖活力 分别收集各组KFB细胞，经胰酶消化后接种至96孔板(1×104个细胞/孔)，24 h、48 h、72 h时每孔分别加入20 μl MTT溶液，培养箱培养2 h后弃上清，每孔分别加入150 μl DMSO振荡10 min，应用酶标仪检测波长为490 nm时各孔相对吸光度值(OD)。

1.2.6流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组KFB细胞，0.25%胰酶消化细胞，调整细胞浓度(1×106个细胞/ml)，配制Annexin V-FITC(5 μl)与结合(500 μl)，分别加入KFB细胞，室温避光孵育15 min，分别加入5 μl PI，利用流式细胞仪在1 h内完成检测，计算各组KFB细胞凋亡率，细胞凋亡率=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%。

1.2.7双荧光素酶报告基因检测 miR-214-5p和SFRP2的靶向关系 通过靶基因预测软件检索调控SFRP2的基因，发现miR-214-5p可能调控SFRP2基因，构建含有miR-214-5p结合位点的野生型WT-SFRP2质粒与含有miR-214-5p结合位点突变的突变型MUT-SFRP2质粒，用脂质体转染法分别将WT-SFRP2、MUT-SFRP2质粒转染KFB细胞，然后转染miR-214-5p mimic或miR-NC培养24 h，根据双荧光素酶活性检测试剂盒测定细胞荧光值。分别将miR-NC、miR-214-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-214-5p转染至KFB细胞(miR-NC组、miR-214-5p组、anti-miR-NC组、anti-miR-214-5p组)，培养48 h后收集细胞，采用Western印迹检测SFRP2蛋白表达量。

1.3统计学方法 采用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1KFB和NFB中miR-214-5p和SFRP2表达水平比较 KFB细胞中miR-214-5p表达水平显著低于NFB细胞(P<0.05)，而SFRP2 mRNA与蛋白表达水平显著高于NFB组(P<0.05)。见图1，表1。

图1 SFRP2蛋白在KFB和NFB中的表达

表1 miR-214-5p在KFB和NFB中的表达

2.2miR-214-5p过表达对KFB增殖的影响 miR-214-5p组KFB细胞增殖活力明显低于miR-NC组(P<0.05)，与miR-NC组相比，miR-214-5p组CyclinD1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，而p21、p27蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，见图2、表2。

图2 miR-214-5p过表达对KFB中增殖相关蛋白表达的影响

表2 miR-214-5p过表达对KFB增殖的影响

2.3miR-214-5p过表达对KFB凋亡的影响 转染miR-214-5p mimic后KFB细胞凋亡率显著高于miR-NC组(P<0.05)，Bcl-2表达水平显著降低(P<0.05)，而Bax、酶切caspase-3表达水平均显著升高(P<0.05)，见图3、图4、表3。

图3 miR-214-5p过表达对KFB中凋亡相关蛋白表达的影响

图4 miR-214-5p过表达对KFB中凋亡率的影响

表3 miR-214-5p过表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)凋亡的影响

2.4miR-214-5p靶向调控SFRP2的表达 SFRP2与miR-214-5p存在结合位点，见图5。共转染miR-214-5p mimic与WT-SFRP2野生型质粒的KFB细胞相对荧光素酶活性显著低于共转染miR-NC与WT-SFRP2野生型质粒的KFB细胞(P<0.05)，表明miR-214-5p可与SFRP2基因的3′UTR结合而调控其活性。miR-214-5p组SFRP2蛋白(0.17±0.03)显著低于miR-NC组(0.58±0.05，P<0.05)；anti-miR-214-5p组SFRP2蛋白(0.92±0.08)显著高于anti-miR-NC组(0.59±0.06,P<0.05)。见图6、表4。

1～4:miR-NC组，miR-214-5p组，anti-miR-NC组，anti-miR-214-5p组图6 miR-214-5p调控SFRP2蛋白的表达

图5 SFRP2的3′UTR中含有与miR-214-5p互补的核苷酸序列

表4 双荧光素酶报告实验

2.5抑制SFRP2表达对KFB增殖和凋亡的影响 相较于si-NC组，转染si-SFRP2可显著抑制细胞增殖及显著促进细胞凋亡，见图7、表5。

图7 抑制SFRP2表达对KFB增殖、凋亡蛋白表达的影响

表5 抑制SFRP2表达对KFB增殖和凋亡的影响

2.6SFRP2过表达逆转了miR-214-5p过表达对KFB增殖和凋亡的作用 共转染miR-214-5p mimic与pcDNA-SFRP2后细胞增殖活力显著高于miR-214-5p+pcDNA组(P<0.05)，与miR-214-5p+pcDNA组比较，miR-214-5p+pcDNA-SFRP2组细胞凋亡能力显著降低(P<0.05)，见图8、表6。

1～2：miR-214-5p+pcDNA组，miR-214-5p+pcDNA-SFRP2组图8 SFRP2过表达逆转了miR-214-5p过表达对KFB增殖和凋亡相关蛋白表达的作用

表6 SFRP2过表达逆转了miR-214-5p过表达对KFB增殖和凋亡的作用

3 讨 论

瘢痕疙瘩形成实质为结缔组织增生，主要是创伤愈合后结痂部分过度生长导致的一种异常瘢痕组织，严重影响患者身心健康，目前临床尚无有效治疗方案〔8〕。研究表明KFB增殖过快及细胞非正常凋亡是导致瘢痕疙瘩形成的主要原因〔9〕。miRNA可通过抑制靶基因表达进而抑制基质金属蛋白酶表达，从而减缓瘢痕形成〔10〕。

miR-214-5p在胰腺癌细胞中呈低表达，上调miR-214-5p表达可抑制胰腺癌细胞迁移及侵袭〔11〕。Li等〔12〕研究表明miR-214-5p可通过调控基因表达进而抑制肝细胞癌细胞迁移及侵袭。研究报道指出miR-214-5p可通过靶向调节Ⅳ型胶原蛋白α表达，进而抑制成骨细胞MC3T3-E1细胞存活及细胞外基质形成过程〔13〕。miR-214-5p的表达变化主要集中于肿瘤发生及发展进程。本研究结果说明miR-214-5p表达水平降低可能参与瘢痕形成过程。miR-214-5p过表达后KFB细胞中p21、p27蛋白表达水平升高，而CyclinD1蛋白表达水平降低。研究显示p21、p27蛋白表达水平升高可抑制CyclinD1与CDK4/6形成复合物，并诱导细胞周期停滞，抑制细胞增殖〔14,15〕。同时本研究结果提示miR-214-5p过表达能够通过影响凋亡相关蛋白表达进而促进KFB凋亡。

研究表明SFRP2在KFB中呈高表达，并可通过调控Wnt /β-连环蛋白信号通路进而参与伤口愈合过程〔16～18〕。本研究结果提示miR-214-5p可能通过调控靶基因SFRP2表达，进而参与瘢痕疙瘩形成过程。本研究结果提示miR-214-5p可通过抑制SFRP2表达，进而抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖并诱导细胞凋亡。

综上，miR-214-5p过表达能明显抑制KFB增殖活性，并提高细胞凋亡水平，其作用机制可能为通过抑制靶基因SFRP2表达而发挥作用的，并可通过调控细胞增殖及凋亡蛋白表达进而调节成纤维细胞增殖/凋亡的平衡状态。