辛伐他汀对慢性阻塞性肺疾病大鼠氧化/抗氧化失衡的影响

赵华栋 朱勇 魏东阳

(锦州医科大学附属第三医院，辽宁 锦州 121000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是以气流受限为特征的肺部疾病，其发病机制可能是由肺及全身系统炎症以及氧化应激机制导致，气道的炎症反应与氧化应激密切相关，调节氧化抗氧化平衡在COPD治疗中具有重要意义。他汀类药物已被证实能够减轻COPD肺部及系统性炎症反应，但其是否通过抗氧化发挥对COPD保护作用有待进一步研究。本研究通过烟熏法加脂多糖诱导法复制COPD模型，观察辛伐他汀对COPD大鼠氧化抗氧化失衡的影响。

1 材料与方法

1.1材料 辛伐他汀(常州九天医药公司，生产批号：20070901)；哈德门牌香烟(山东中烟工业公司，焦油含量13 mg，烟碱量为1.2 mg，烟气一氧化碳量为15 mg)；大鼠吸烟装置(JY-01型，石家庄绵阳科技开发有限公司，中国)；小动物肺功能仪(Flexivent，加拿大 )；丙二醛(MDA)测试盒、超氧化物歧化酶(SOD)测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)均购自南京建成科技有限公司。健康雄性SD大鼠24只(中国医科大学动物实验中心，许可证号1501003)，体重(100±9)g，SPF级饲养，饲料和水严格灭菌。

1.2方法

1.2.1分组与模型制作 大鼠经1 w适应喂养后，24只大鼠按随机数字表法分为3组，每组8只。对照组：第1、15天气管内滴入生理盐水0.2 ml，其余时间正常喂养；COPD模型组：第1、15天气管内滴入脂多糖0.2 ml，将8只大鼠放进大鼠吸烟装置染毒箱内，箱上端有两个(1.5 cm×1.5 cm)小孔与外界相通，防止动物缺氧，香烟去掉过滤嘴后插入染毒箱中点燃，关闭染毒箱，1 h后取出大鼠，休息12 h后再重复以上操作1次，连续熏烟5 w，每次熏烟结束后，将COPD模型组置于和对照组相同的环境中喂养饲料。辛伐他汀组：建立COPD模型组方法同上，每次熏烟结束后，给予辛伐他汀灌胃治疗(5 mg/kg)，置于相同的环境中喂养。造模成功标准：COPD造模成功大鼠可见气管、支气管黏膜上皮纤毛倒伏，部分上皮脱落，杯状细胞增生，黏膜下层及肌层大量炎症细胞浸润，部分腺泡萎缩，血管周围有炎症细胞浸润，肺泡壁断裂。同时大鼠表现为呼吸急促，不断搔鼻，烦躁不安。

1.2.2肺功能测定与大鼠肺组织标本采集 实验第5周，熏烟结束后，记录各组大鼠体重，腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉大鼠，后仰卧位固定，气管插管，小动物肺功能仪测定大鼠肺功能指标，包括呼气峰流速(PEF)、第1秒用力呼气容积(FEV1)及FEV1/用力肺活量(FVC)。肺功能检测结束后通过股动脉缓慢放血处死大鼠，开胸暴露肺和心脏，进行瘀血清理和冲洗，完整取下，利用生理盐水进行肺血管冲洗，以无菌棉签分出各个肺叶，肺叶用生理盐水冲洗后放入冷冻管，置于液氮中储存处理，另一个肺叶放入装有甲醛的广口瓶中。

1.2.3大鼠肺组织苏木素-伊红(HE)染色病理观察 10%中性甲醛固定大鼠肺组织72 h，脱水、石蜡包埋连续切片，脱蜡至水，蒸馏水浸泡后，苏木素染色，1%盐酸酒精分色浸泡，伊红溶液染色，乙醇脱色，二甲苯透明。应用中性树胶封片，置于玻片架上自然烘干，应用显微镜(日本Olympus)采集图片，置于显微镜图像处理系统(中国医科大学BHEC)下观察肺组织病理形态并测量：①平均肺内衬间隔(MLI):以视野正中为中心划十字交叉，计数通过该交叉线的肺泡间隔数，MLI=十字线总长度/肺泡间隔数，其数值反映肺泡平均直径;②平均肺泡数(MAN):计数各视野内肺泡数，测出各视野面积，平均肺泡数 = 视野内肺泡数/各视野面积，该数值反映肺泡密度。

1.2.4肺组织中MDA、SOD、GSH-Px活性测定 准确称量肺组织，按10%比例加入冷生理盐水于玻璃匀浆器中冰上匀浆，匀浆液4℃、4 000 r/min离心10 mim，上清液用考马斯亮蓝法行蛋白定量，取上清液按照试剂盒说明书操作测定以上指标。

1.3统计学方法 采用SPSS19.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组体重比较 各组烟雾暴露实验开始前体重差异无统计学意义(P>0.05)；暴露实验结束后，测得COPD模型组及辛伐他汀组体重均显著低于对照组(P<0.05)；而COPD模型组与辛伐他汀组体重差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3组体重、肺功能指标、肺组织病理

2.2各组肺功能指标水平比较 COPD模型组PEF、FEV1和FEV1/FVC均显著低于对照组(P<0.05)；辛伐他汀组PEF、FEV1和FEV1/FVC均显著高于COPD模型组,但仍显著低于对照组(P<0.05)。见表1。

2.3各组病理学观察及评分 对照组肺泡及气管壁轮廓清晰，未见炎症浸润。可见正常肺泡间隔，未见肺大泡存在，肺动脉壁无增厚；COPD模型组可见气管壁有明显增厚，管腔变窄，气管壁及周围有炎性浸润，肺大泡及肺气肿可见形成，并且肺动脉壁增厚；辛伐他汀组见气管壁仍增厚，仍可见肺气肿，但相较于COPD模型组明显局限，气管壁周围炎症浸润减轻，肺泡扩张降低，血管管腔狭窄减轻，见图1。COPD模型组MLI显著高于对照组，MAN显著低于对照组(P<0.05)；辛伐他汀组MLI显著低于COPD模型组，MAN显著高于COPD模型组(P<0.05)。见表1。

图1 各组肺组织病理变化(HE，×400)

2.4各组肺组织MDA含量、SOD、GSH-Px活性比较 COPD模型组MDA含量显著高于对照组，而SOD和GSH-Px活性均显著低于对照组(P<0.05)；辛伐他汀组MDA含量显著低于COPD模型组,但显著高于对照组(P<0.05)，辛伐他汀组SOD和GSH-Px活性显著高于COPD模型组，但显著低于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 各组肺组织MDA、SOD、GSH-Px活性水平比较

3 讨 论

COPD发病机制尚不完全清楚，目前认为与气道和肺部慢性炎症、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、氧化应激等有关，其中氧化应激作为COPD启动的关键因素，包括臭氧、二氧化硫、颗粒物质、过氧化氢及活性氧物质等外源性和内源性氧化物直接或间接损伤气道和肺部，促进炎症反应、导致蛋白酶/抗蛋白酶失衡，在COPD发生发展中具有重要作用〔1，2〕。同时在氧化应激损伤中，也可引起脂质过氧化作用，形成MDA，而肺组织则通过强有力的酶性系统(SOD、GSH-Px、过氧化氢酶)和非酶性抗氧化系统使机体减轻氧化应激损伤，改善氧化抗氧化失衡状态。

本研究结果说明COPD大鼠肺组织抗氧化能力降低，这与既往发现COPD动物模型存在过氧化物酶活性受损的研究结果一致〔3，4〕，而在对COPD患者血清检测也发现存在着SOD、GSH-Px活性下降〔5〕，以上研究结果与COPD发病机制中存在氧化应激增强及氧化抗氧化失衡的表现一致〔6〕。

前期研究发现辛伐他汀可以减轻COPD大鼠肺组织及全身炎症反应，改善COPD发生发展及预后〔7〕。辛伐他汀应用于临床治疗COPD急性加重期患者也能够减轻炎症反应，提高氧分压及改善患者肺功能〔8〕。本研究结果说明辛伐他汀可以降低COPD大鼠氧化应激损伤，增强抗氧化能力，改善氧化抗氧化失衡，这可能是辛伐他汀治疗COPD的另一作用机制。