骨关节炎软骨缺损修复的动物实验研究❋

张熙南，张君涛，靳 博

(天津中医药大学第一附属医院，天津 300193)

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种常见的关节退行性疾病，可累及1个或多个关节。有数据显示，在60岁以上人群中，9.6%的男性和18%的女性患有症状性的OA[1，2]，其结构改变常表现为关节软骨缺损、骨赘形成、软骨下骨硬化及周围软组织黏连等[3]。临床治疗主要包括药物、理疗、手术等，但效果并不理想。近年来，随着组织工程学的发展，通过软骨再生提供生物学的解决方案成为OA的治疗前景，即通过干细胞培养、组织工程支架及生长因子等提高软骨的再生潜力，降低炎症反应的同时，达到修复软骨缺损的目的。

在进入临床治疗之前，动物实验研究对于检验软骨组织工程的安全性及有效性具有重要作用，这些模型不仅可模拟人类关节软骨缺损不同时期的不同形态，还可弥补体外研究和人体临床实验之间的差距。同时，随着关节软骨修复重建的方法越来越多，对动物模型的准确性及规范性要求也越来越高。如何合理地将动物模型与软骨组织工程相结合，把软骨再生从理想带入现实等都是迫切需要解决的问题[4，5]。因此，本文对现有的动物关节软骨缺损修复的相关文献进行述评，现报道如下。

1 现代医学软骨缺损修复的相关研究

1.1 多种细胞诱导软骨再生

早期用于修复软骨缺损的细胞疗法就是基于软骨细胞开展的。Brittberg M等[6]首先运用自体软骨细胞移植术治疗OA，但由于难以获得足够数量的软骨细胞和供体部位发病率等问题，其效果并不理想。随着人工细胞载体和新培养方法的引入，利用软骨细胞修复软骨缺损的方法再次受到关注。Nixon AJ等[7]将马自体软骨细胞接种到I型或III型胶原膜上，并植入到股骨滑车脊缺陷中，观察到缺陷处软骨生长良好，II型胶原蛋白含量增加，且软骨下骨或软骨对植入物的排斥反应很小。Bothe F等[8]通过猪的实验模型发现，猪幼崽的软骨细胞生长速度明显快于成年猪软骨细胞，软骨形态更接近于天然软骨，具有更高的蛋白多糖和II型胶原蛋白。但软骨细胞在体外培养的过程中，存在细胞去分化及表型缺失等问题。因此，如何寻找一种高表达、低分化的细胞，成为研究软骨再生的突破口。

多能干细胞具有分化成多种组织类型的能力，并且可无限制地生成具有低转换率且难以获得的细胞类型。尽管以前认为成熟的胚胎干细胞只能分化成具有组织或器官特征的细胞谱系，但最近的研究表明，成熟的多能干细胞在软组织损伤、骨损伤、创伤愈合和衰老过程中都能参与修复过程。Rim YA等[9]将多能干细胞诱导分化成软骨细胞后植入大鼠的OA模型，证实了多能干细胞衍生的软骨细胞用于软骨修复的可能性。Xu等[10]向家兔的软骨缺陷模型中植入由诱导多能干细胞衍生的间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MCS)，发现软骨缺损处重新再生出软骨样组织并得出结论，多能干细胞具有修复软骨缺损的潜力。然而多能干细胞可能存在致瘤性及伦理等问题，但部分学者认为其致瘤性与多因素相关。最近的研究显示，移植细胞的数量与它们和受体的组织相容性程度、宿主的免疫抑制和移植部位等共同决定多能干细胞的致瘤性。Pilichi S等[11]通过4年的绵羊动物实验，证实胚胎干细胞用于软骨再生工程的安全性和可靠性。

此外，MCS以其高增殖、多能分化及极少致瘤性的特点备受青睐。目前采用骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)修复软骨缺损的技术已经进入临床。Khalilifar MA等[12]将家兔BMSCs在体外培养扩增，接种在支架材料上并植入家兔软骨缺损模型中，4周后发现软骨缺损得到明显改善。脂肪来源的间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells，ADSCs)也是一种较好的选择。小鼠实验证实，ADSC虽比BMSC形成的软骨数量少，但ADSCs来源更丰富，且更容易获得。滑膜间充质干细胞(synovial mesenchymal stem cells，SMSCs)在软骨再生能力方面优于骨髓和脂肪来源的MSC。有数据显示，与BMSCs比较，SMSCs诱导形成的软骨组织数量增加了9倍，硫酸蛋白多糖沉积增加了13倍。但由于SMSCs保留了一些成纤维细胞的能力以及较低的分离效率，限制了其在软骨组织工程中的应用[13]。此外，将不同种类的MSC混合培养以后，共培养体系中MSC具有更高的增殖潜力，更适合于软骨再生的选择。

1.2 支架材料促进软骨缺损修复

对于组织工程而言，支架材料对于软骨再生至关重要。支架的结构、生物力学和生物化学特性可以影响细胞的存活率和分化能力。用于软骨组织工程的支架主要包括天然聚合物、合成聚合物以及含有生物材料组合的复合聚合物。天然聚合物由于生物相容性好、细胞毒性低、可降解等优点已被大量用于实验研究。Chen Y等[14]以丝素蛋白-多孔明胶(silk fibroin-porous gelatin scaffold，GSTS)构成可持续释放负载基质细胞衍生因子1α和转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的缓释支架，与BMSCs一同接种到大鼠膝关节骨软骨缺损处，发现GSTS可通过促进BMSCs归巢和软骨的形成分化来增强软骨修复。藻酸盐、壳聚糖等这一类以碳水化合物为主的天然支架，因其具有捕获自由基形成稳定大分子的功能，可增强细胞的附着和增殖能力。Erickson AE等[15]基于软骨包括关节软骨和软骨下骨的理念，设计出符合生物化学和生物力学要求的双层壳聚糖支架，可同时搭载成骨细胞和软骨细胞，产生具有类似于天然骨软骨组织的再生软骨。但Huang等[16]认为，天然聚合物形成的支架材料存在机械强度差、易受物理变化影响的弊端，很难作为长期植入材料使用。

合成聚合物相较于天然聚合物来说具有良好的机械性能。Jiang等[17]发现，聚己内酯-聚四氢呋喃形成的支架具有诱导大鼠MSC软骨形成和加速受损软骨表面再生的能力。有学者通过猪的模型发现，聚乳酸-羟基乙酸聚合物(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)支架，可促进骨软骨再生[18]。然而，合成聚合物在降解时释放酸性物质容易导致局部酸中毒，其安全性有待提高。生物陶瓷形成的支架具有较好的生物活性，能与骨骼形成快速而强烈的黏合，且不存在生物毒性。Bunpetch V等[19]通过硅酸盐基生物陶瓷支架搭载BMSCs注入家兔髌骨软骨缺损处，发现软骨和软骨下骨再生，并且在体外培养过程中还发现硅酸盐基生物陶瓷支架有助于维持软骨细胞表型。

近年来，随着各种新型可注射性医用材料的出现，双层支架以及联合蛋白质、生物活性物质等形成的复合支架成为研究热点。这些复合支架既解决了生物相容性的问题，又能满足生物力学的需要，还可以通过激活信号通路提高促表达能力。

1.3 生长因子调控软骨细胞形成

生长因子作为一种生物活性多肽，可以刺激细胞分裂、生长和分化。在关节软骨中，许多生长因子共同调节关节软骨的发育和体内平衡。有研究证实，生长因子可刺激软骨细胞合成蛋白多糖、蛋白聚糖和 II 型胶原，诱导滑膜细胞和BMSCs增殖，促进BMSCs向软骨分化[20]。Ongchai S等[21]利用马实验模型发现，TGF-β1对马软骨细胞具有刺激作用，可增强透明质酸的合成，并促进软骨基质产生。但Murata K[22]却认为，TGF-β1与骨关节炎过程中骨赘的形成有关，TGF-β1应用于软骨组织工程时需考虑其可能产生的副作用。胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor 1，IGF-1)具有维持关节软骨完整性，诱导关节软骨修复的同时降低其分解代谢的能力。Peng等[23]研究发现，IGF-1对BMSCs向软骨细胞形成分化具有促进作用，同时能提高II型胶原蛋白表达，其机制与IGF-1能抑制线粒体膜电位的丧失，阻止线粒体通透性转换孔的开放和细胞内活性氧的释放有关。

成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)广泛存在于各种组织中。Endo K等[24]通过FGF-2实现了犬MCS向软骨细胞的分化，促成了软骨再生。此外，FGF既能通过与细胞表面受体结合，促进合成代谢降低分解，又能在高浓度状态下降低脂多糖刺激的滑膜成纤维细胞中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白细胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)的表达水平，参与骨关节炎的过程。而血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)作为MCS的趋化因子，具有增加蛋白多糖的产生和增殖细胞的作用。有学者发现，重组血小板衍生生长因子-BB(platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB)能显著改善软骨细胞对 II 型胶原的合成代谢过程，抑制软骨细胞体积增大，减缓大鼠骨关节炎的进展，且PDGF-BB还能促进血管生成，改善软骨的血供[25]。此外，通过多模式的联合可大幅度提高软骨再生能力，但由于其可变因素较多，使得再生软骨达不到预期效果，并且过表达现象也是需要解决的问题(见表1)。

表1 各种诱导软骨再生方式的优缺点

2 中药在软骨缺损修复中的作用研究

OA属于中医学痹证范畴。《素问·痹论篇》中认为，其病因是“风寒湿三气杂至，合而为痹也”，同时《灵枢·刺节真邪》提到“虚邪之中人也，洒淅动形，起毫毛而发腠理。其入深，内搏于骨，则为骨痹”。中医药在治疗OA时表现出独特优势，其主要作用在于缓解疼痛、改善膝关节功能[26]。其中针刺、艾灸、按摩等在抑制相关炎症因子的表达，调控信号通路，减轻炎症反应等方面效果良好，但对于软骨缺损的修复却收效甚微。

中药在治疗OA时，既可通过抑制炎性因子的表达减缓软骨细胞损伤，又可通过调节各种生长因子刺激软骨细胞生长。此外，通过辨证论治可以满足不同患者的个性化需求。但由于中药成分较复杂，且在治疗OA的过程中并不单一发挥作用[27]，所以针对中药修复软骨缺损的研究，既需要掌握传统中医理论及中药特性，又需要结合现代的药物研究方法。在研究的过程中，主要依据中药的功效类型，并将其分为补肾强骨类、化瘀止痛类、行气活血类、清热利湿类。

2.1 补肾强骨类

“肾主骨生髓”的理论来源于《黄帝内经》，肾虚血瘀贯穿整个OA的病理过程，所以补肾强骨是治疗OA的关键。淫羊藿具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效。Mi B等[28]通过大鼠实验研究证实，淫羊藿苷可通过下调软骨细胞核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信号介导的软骨细胞凋亡，促进成骨细胞的增殖和分化，抑制破骨细胞生成，从而减缓骨关节炎软骨退化。同时，淫羊藿苷还能通过调节TDP 43基因，抑制关节软骨细胞的凋亡，同时增加滑膜组织中新血管的形成。此外，有学者将淫羊藿苷含药血清和透明质酸结合注射到家兔OA模型中，发现可以促进软骨缺损的修复，并增加新的软骨形成[29]。

牛膝是治疗OA的常用中药，具有补肝肾、强筋骨的作用。Xu等[30]发现，牛膝可以通过下调基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)3和9以及环加氧酶-2的表达，减轻IL-1β诱导的炎症和基质降解，从而抑制大鼠软骨细胞中IL-1β诱导的NF-κB活化，从而抑制OA的进展。此外，牛膝还可以诱导β-连环蛋白核转位，使β-连环蛋白和细胞周期蛋白D1的表达，被Dickkopf-1因子部分抑制，从而激活Wnt/β-连环蛋白信号传导途径，促进软骨细胞增殖，增加软骨细胞中II型胶原的表达[31]。

鹿茸是温补肾阳的要药，具有补肾阳、益精血、强筋骨的功效。Wang等[32]将鹿茸多肽与丝素蛋白/胶原/透明质酸制备成复合支架共同植入兔软骨缺损模型中，13周后发现软骨缺损几乎完全修复，且与单纯使用丝素蛋白/胶原/透明质酸复合支架相比，结合鹿茸多肽的支架，可明显提高软骨缺损修复能力。

2.2 化瘀止痛类

《素问·举痛论篇》中认为，疼痛是“痛而闭不通”。而痹证多由“外邪”闭阻经络，导致气血运行不畅所致，所以临床在治疗OA时常配伍一些舒经活络、散瘀止痛的药物。虎杖具有清热解毒、散瘀止痛的功效。Deng等[33]发现，虎杖可以通过影响NF-κB调节MMP基因的表达来抑制OA的进展。此外，虎杖还可通过激活SIRT1基因，促进MSC向软骨细胞分化，同时抑制IL-1β和TNF-α的表达，以修复关节软骨缺损[34]。

红花具有活血通经、散瘀止痛的作用。羟基红花黄色素是医疗和食用两用植物红花中的主要活性成分。Hu等[35]通过小鼠OA模型发现，它可通过降低MMP和血小板反应蛋白基序5的表达，减弱IL-1β诱导的细胞外基质的降解，同时抑制IL-1β诱导NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)级联的激活，从而达到保护软骨细胞的作用。

葛根在治疗OA时主要发挥其通筋活络的功效。Wang等[36]发现，葛根可通过上调OA大鼠中单磷酸腺苷活化蛋白激酶(amp-activated protein kinase，AMPK)增殖物激活受体-γ共激活因子信号通路来减轻OA。同时，葛根还可降低小鼠OA组织中C-C趋化因子配体2的表达，限制炎性单核细胞的聚集。

2.3 行气活血类

基于《医宗必读·痹》所论：“治风先治血，血行风自灭”[37]，在治疗以OA为主的痹证时，会添加一些以行气活血为主的中药。川芎具有活血行气、祛风止痛的功效。Li等[38]通过大鼠OA模型发现，川芎嗪可通过抑制SIRT1基因或NF-κB通路，激活核转录因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-derived 2-like 2，Nrf2)或血氧合酶1(hemooxygenase 1，HO-1)通路，从而降低IL-1β和TNF-α的血清水平，减轻OA的进展。同时川芎嗪还可通过调节SOX9基因和NF-κB信号通路，使软骨细胞免受IL-1β诱导的损伤[39]。

姜黄具有破血行气、通经止痛的作用。Feng等[40]通过大鼠OA模型发现，姜黄素可通过促进软骨细胞中SIRT1基因表达，而抑制内质网应激相关的蛋白激酶R样内质网激酶真核翻译起始因子同源蛋白通路(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase-eukaryotic translation initiation factor 2-C/EBP homologous protein，PERK-eIF2-CHOP)，降低软骨细胞的内质网应激，减缓OA的发展。

黄芪是补气运脾的要药，具有补中益气、升阳举陷的功效，临床中常用于治疗气虚或气陷等病证，并不是治疗OA的常用药。但Li等[41]却发现，黄芪可通过抑制IL-1β诱导的炎性因子，包括IL-6、TNF-α、NO、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、MMP13和含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶5(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin-like motifs 5，ADAMTS-5)的表达，以及NF-κB信号的激活，从而改善OA小鼠模型中软骨的损伤。此外作者还发现，黄芪可通过上调软骨细胞自噬活性，抵抗IL-1β诱导的软骨细胞凋亡。

2.4 清热利湿类

《症因脉治·痹症论》首次系统地对“热痹”这种特殊的类型予以论述，当关节出现红肿疼痛时可以清热利湿为主要治疗方法[42]。黄芩和黄连都具有清热燥湿、泻火解毒的作用。Chen等[43]通过小鼠OA模型发现，黄芩可显著抑制IL-1β刺激的NF-κB活化，不仅防止软骨的破坏，还减轻了OA模型小鼠的滑膜炎。

大黄具有清热泻火、凉血解毒的功效。Ding等[44]向大鼠OA模型中注射大黄素，发现大黄素能下调IL-1β刺激的大鼠软骨细胞中MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5 mRNA和蛋白质的表达，减弱IL-1β诱导的NF-κB和Wnt信号激活，改善OA的进展。

综上表明，中药运用于软骨工程时，其作用主要通过抑制促炎细胞因子的活动，调节活性氧诱导的线粒体信号传导，下调MAPK和Wnt/β-catenin信号表达，以及对MMP和ADAMTS活性的抑制与合成代谢活性的增加来调控软骨缺损的修复。但中药在OA中的作用尚未完全阐明，且针对中药复方的研究较少，由于其成分多样性的特点，使得其研究方法较局限。此外，中药单体作用能力有限，存在新生软骨数量少、软骨成分中纤维软骨数量多、与关节形合度差等问题。所以，通过将中药与种子细胞、支架材料及生长因子等相结合的方法，既能改善OA模型中的“微环境”，减轻炎症反应导致的软骨损伤，又能调节并维持软骨细胞表型，促进干细胞向软骨的定向分化，从而减缓OA的进展。

3 总结与展望

近年来，软骨组织工程发展迅速，开辟了许多新的方法。无论是针对哪种方法的研究，其目的都是为了减缓软骨缺损的进展，促进软骨或软骨细胞再生，提高再生软骨中透明软骨的含量。动物实验作为体外研究和人类临床应用之间的过渡阶段，通常从细胞层面分析细胞表型的缺失和致瘤性，评估生物材料的生物相容性、毒性和降解能力。本文系统阐述了软骨缺损修复的动物实验研究进展，在结合中医理论及现代药学研究方法的基础上，重点叙述了中药在软骨工程中的研究现状。但由于软骨再生的过程中可变因素较多，再生软骨无论从数量或者生物学特性上均达不到预期效果，所以目前还没有发现与天然软骨相似的工程软骨。

在今后的研究中，对种子细胞的研究不仅需要获得稳定的软骨细胞表型，防止软骨基质和细胞退化，同时还要提高软骨细胞的表达能力，让II型胶原蛋白得到高表达。软骨工程的支架材料既要在体内达到无毒降解，也要在保证机械强度的同时提高组织和细胞相容性，便于诱导细胞生长和分化，同时限制细胞迁移。生长因子则需要解决使用相关蛋白质结构不稳定、免疫原性高、易形成炎症因子等不良反应以及如何避免负载材料与生长因子发生反应等问题。此外，中药在抑制炎症反应的过程中表现良好，如何将研究由中药单体转变为中药复方以提高再生软骨的数量及质量是今后需要努力的方向。将中药的研究加入到种子细胞、支架材料、生长因子这“三大基石”中，让其形成“四足鼎立”的局面，以便于在减轻OA症状的同时也能使软骨缺损得到修复。希望能将部分动物研究的成果尽快转化到临床，改善软骨缺损的治疗现状，提高患者生活质量。