解毒生肌膏对糖尿病溃疡大鼠创面局部IL-6、TNF-α表达的影响❋

黄洁雅，陈 丽，周忠志，戴飞跃，张 扬，陈敏敏，刘 慧，姜佳呈，廖亮英△

(1.湖南中医药大学，长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，长沙 410007)

皮肤溃疡是糖尿病常见并发症之一，严重影响患者生活质量甚至危及生命[1]。大量研究表明，糖尿病皮肤溃疡的发病机制复杂，多种因素均可导致发病[2]，其中炎症反应为主要因素，白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)为反应主要因子[3，4]。解毒生肌膏由全蝎、蜈蚣、乳香、没药4味中药按君臣佐使原则精密配伍制成，在临床治疗糖尿病皮肤溃疡数年，获得了较好的临床疗效。本课题组在前期临床应用基础上，构建糖尿病大鼠全层背部皮肤缺损模型，拟通过肉眼观察创面愈合情况，苏木精-伊红(HE)染色法观察组织形态学改变，免疫组化法分析IL-6、TNF-α阳性表达量变化等技术对该药促进溃疡愈合的机制进行研究。本研究由湖南中医药大学第一附属医院伦理委员会审核通过，批准编号LL2019112001。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级健康雄性SD大鼠45只，4～6周龄，体质量180～220 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证SCXK(湘)2016-0002，统一饲养于湖南中医药大学动物房。清洁并消毒动物房及鼠笼；雄性SD大鼠分笼饲养，每笼大鼠5只共9笼；饲养环境为清洁级，湿度保持在45%～75%，室温控制在20～25 ℃。大鼠标准饲料和饮用矿物质水饲养，自由饮食饮水，每天补充1次饲料和水，更换1次垫料并消毒笼具，光暗周期12 h。

1.2 药物

解毒生肌膏药物组成：全蝎、蜈蚣、乳香、没药4味中药，湖南中医药大学第一附属医院(专利申请号JSI01039ZYFS)；磺胺嘧啶银乳膏，新乡市华信药业有限公司(批号H20094208)；链脲佐菌素(STZ)，sigma-aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(货号S0130)；柠檬酸钠缓冲液，北京索莱宝科技有限公司(货号C1013)；6-正丙基-2-硫代尿嘧啶，上海源叶生物科技有限公司(货号S30643)；胆酸钠(猪)，上海源叶生物科技有限公司(货号S30219)；吐温-80，天津市科密欧化学试剂有限公司(批号20130128)；1,2-丙二醇，湖南汇虹试剂有限公司(批号20160412)；Anti-IL-6 抗体，Abcam公司艾博抗(上海)贸易有限公司(货号ab9324)；Anti-TNF Receptor II antibody[EPR1653]，Abcam公司艾博抗(上海)贸易有限公司(货号ab109322)。

1.3 试剂

1.3.1 高脂乳剂的配制 将100 g食用猪油放到水浴锅上加热，以澄清油样透明为准。取50 g胆固醇分多次加入研钵，研磨至无亮光后将其加入，并充分搅拌混匀于100 g猪油中，然后依次搅拌加入1 g丙硫氧嘧啶、10 g胆酸钠、已预热的100 mL吐温-80和100 mL丙二醇，最后缓慢加入适量蒸馏水定容至500 mL并摇晃均匀。

1.3.2 链脲佐菌素溶液的配制 分别取出100 mg冷冻保存的链脲佐菌素粉末(STZ)和5 mL冷藏保存的柠檬酸钠缓冲液，将STZ溶解于柠檬酸钠缓冲液中，配制浓度为20 mg/mL的STZ溶液，避光操作，30 min内配制并使用。

1.3.3 分组药物制备 适应性喂养雄性SD大鼠3 d后，将45只大鼠按随机数字表法分成模型组、解毒生肌膏组和磺胺嘧啶银乳膏组各15只。3组大鼠均分别随机分为3个时间点：即3 d、7d、21 d，每个时间点5只大鼠。药物制备方法按一定比例混合磨碎加工佐以凡士林调和制成，试验全过程使用同种剂量药物。

1.3.4 糖尿病大鼠创面模型制备[5，6]每天同一时间段以2 ml/只的剂量，连续灌胃各组雄性SD大鼠高脂乳剂2周。各组雄性SD大鼠禁食不禁水，24 h之后按照40 mg/kg剂量腹腔注射配制浓度为20 mg/mL的STZ溶液。72 h后将各组雄性SD大鼠剪尾取血，测定随机血糖水平超过16.7 mmoL/L则为2型糖尿病大鼠模型造模成功。按照3.5 mL/kg的剂量腹腔注射10%水合氯醛麻醉各组2型糖尿病大鼠并备皮，在大鼠已脱毛的背部脊柱两侧标记2个对称直径为1.5 cm的圆形图案，常规消毒后且沿标记线用手术刀创设2个全层皮肤缺损区域，创面深达筋膜层，即成功建立2型糖尿病大鼠皮肤创面模型。

1.3.5 给药 造模成功后，模型组不做处理，解毒生肌膏组大鼠创面上立即均匀被覆一层解毒生肌膏，磺胺嘧啶银乳膏组的大鼠创面上立即均匀被覆一层磺胺嘧啶银乳膏，并每天进行换药。

1.3.6 血糖测量 (1)剪尾法：调试、校对血糖仪插入匹配试纸，消毒后于大鼠尾尖剪除约0.3 cm，并从尾根部向尾尖捋挤，流出第一滴血弃去不用，第二滴血吸于血糖仪试纸吸血点，按压大鼠尾部止血，读取血糖结果并记录；(2)测量时间：分别于适应性喂养第3天、高脂乳剂喂养第14天后(STZ注射禁食前)、STZ注射第72 h后、糖尿病大鼠造模成功后每3 d以及取材当天同一时间段进行随机血糖测量。

1.3.7 标本采集 分别于造模后3 d、7d、21 d为模型组、解毒生肌膏组和磺胺嘧啶银乳膏组对每个时间点的大鼠进行取材。首先将大鼠麻醉观察创面愈合情况并拍照记录，冰上以创面为中心取大小为2 cm×2 cm的标本，于4%多聚甲醛溶液的瓶中固定，常温保存。取材结束后采用颈椎脱臼处死法处死大鼠。

1.3.8 观察指标 (1)创面大体形态学：肉眼观察3组大鼠3 d、7d、21 d时间点；(2)HE染色：10%福尔马林缓冲液浸泡标本一晚后石蜡包埋，制作组织切片(5 μm)进行HE染色做形态学评估；(3)免疫组化法：取皮肤创面标本组织脱蜡至水，抗原修复、孵育，滴加一抗(IL-6浓度0.125 μg/ml，TNF-α稀释浓度1/100-1/250)、反应增强液、增强酶标记的山羊抗小鼠/兔IgG H&L，显色、苏木精复染、脱水、透明和封片，测定3组3个时间点皮肤创面中IL-6、TNF-α受体阳性表达量(通过Image J软件计算得到)。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠血糖结果

图1示，在适应性喂养阶段，各组大鼠的随机血糖值均在5.5～7.8 mmol/L区间内，属正常范围。在高脂乳剂灌胃后即注射STZ禁食前，血糖值未见明显变化。注射STZ后72 h随机血糖值升高明显，各大鼠血糖值均高于16.7 mmol/L，一部分大鼠血糖值升高尤为显著，甚至高于血糖仪测量上限。在造模成功后直到取材前这段时间内，大鼠血糖值有轻微波动且略微下降，但大鼠一直保持着高血糖状态。

图1 实验全过程血糖变化比较

2.2 创面愈合情况

2.2.1 各组各时间点大鼠创面大体形态学结果 图2示，取材前将各时间点大鼠麻醉后对创面进行局部拍照记录，拍照并制作各组大鼠溃疡创面大体形态学示意图。造模后3 d模型组创缘肿胀不明显，创面有少量脓点并有较多分泌物，可见新生肉芽组织(图2-A)；解毒生肌膏组造模后3 d创缘肿胀明显，创口面积缩小，创面分泌物较少，可见新生肉芽组织(图2-D)；磺胺嘧啶银乳膏组肿胀较轻，创面有较多干燥的脓性分泌物(图2-G)。造模后7 d模型组创缘肿胀减轻，创面无明显脓性分泌物，可见较厚痂皮(图2-B)；解毒生肌膏组肿胀明显减轻，创面无脓性分泌物，可见较厚且干燥的痂皮，创口面积明显缩小(图2-E)；磺胺嘧啶银乳膏组肿胀略减轻，可见较干燥且薄的痂皮，创口面积缩小较明显(图2-H)。造模后21 d模型组部分痂皮脱落，创口面积小，创面呈愈合趋势(图2-C)；解毒生肌膏组痂皮脱落，创面基本完全愈合(图2-F)；磺胺嘧啶银乳膏组创面有干燥痂皮覆盖，创口面积较小，创面基本愈合(图2-I)。

注：A.3 d模型组；B.7 d模型组；C.21 d模型组；D.3 d解毒生肌膏组；E.7 d 解毒生肌膏组；F.21 d解毒生肌膏组；G.3 d磺胺嘧啶银乳膏组；H.7 d磺胺嘧啶银乳膏组；I.21 d磺胺嘧啶银乳膏组图2 3、7、21 d时间点各组大鼠溃疡创面大体形态学示意图

2.2.2 各组各时间点大鼠创面HE染色结果 造模后3 d模型组创缘表皮层次多且分布不均匀，创面结构紊乱(图3-1A)，胶原纤维、肌细胞水肿明显(图3-1B1C)；解毒生肌膏组创缘结构完整均一(图3-1D)，创面成纤维细胞和毛细血管增生明显，细胞种类多，肉芽组织丰富(图3-1E1F)；磺胺嘧啶银乳膏组创缘结构较完整(图3-1G1H1I)。造模后7 d模型组创缘新生表皮较厚，层次不清，结构紊乱(图3-2A)，炎症细胞浸润明显(图3-2B)，创面可见大量毛细血管，肉芽组织丰富(图3-2C)；解毒生肌膏组创缘平整且薄，层次均匀清楚(图3-2D)，可见丰富细腻而平行排列的胶原纤维，成纤维细胞多且呈长梭形(图3-2E)，肉芽组织和毛细血管明显(图3-2F)；磺胺嘧啶银乳膏组创缘平整较薄，层次分明(图3-2G)，肉芽组织和毛细血管较多(图3-2H)，可见较多的胶原纤维、成纤维细胞(图3-2I)。造模后21 d模型组创缘见少量新生毛囊(图3-3A3B)，创面成纤维细胞数量多，胶原纤维明显增多但排列紊乱(图3-3C)；解毒生肌膏组创缘表皮基本愈合，结构、层次清楚(图3-3D)，可见较多成熟的新生毛囊和皮脂腺等附属器(图3-3E)，创面胶原丰富，成纤维细胞退化(图3-3F)；磺胺嘧啶银乳膏组创缘表皮愈合(图3-3G)，成纤维细胞减少，胶原纤维粗(图3-3H),附属器发育不成熟(图5-I)。

注：1～3分别为造模后3 d 3组创面HE染色图片、造模后7 d 3组创面HE染色图片、造模后21 d 3组创面HE染色图片；A-C.模型组(A为×20，B为红框内结构×200，C为蓝框内结构×200)；D-F.解毒生肌膏组(D为×20，E为红框内结构×200，F为蓝框内结构×200)；G-I.阳性对照组(G为×20，H为红框内结构×200，I为蓝框内结构×200)图3 3、7、21d时间点各组大鼠溃疡创面HE染色示意图

2.3 各组各时间点创面 IL-6、TNF-α免疫组化结果

IL-6、TNF-α阳性表达部位为巨噬细胞分泌物中，表达为棕黄色颗粒。图4、5及表1、2示，造模后3 d对比模型组和磺胺嘧啶银乳膏组，解毒生肌膏组炎症细胞阳性表达明显增多(P<0.05)；造模后7 d与模型组和磺胺嘧啶银乳膏组比较，解毒生肌膏组棕黄色表达颗粒减少，炎症细胞数量骤减，阳性表达量明显降低(P<0.05)；造模后21 d，除解毒生肌膏组较模型组IL-6表达数量明显降低外(P<0.05)，其余组别比较差异无统计学意义(P>0.05)，较模型组和磺胺嘧啶银乳膏组比较，解毒生肌膏组IL-6、TNF-α表达量提前达到峰值，且表达量峰值低于模型组和磺胺嘧啶银乳膏组峰值。

表1 3、7、21 d时间点各组大鼠溃疡创面 IL-6阳性表达量

注：从上至下依次为3、7、21 d时间点TNF-α表达示意图(免疫组化染色×100)；A-C.3 d时间点(A为模型组，B为解毒生肌膏组，C为磺胺嘧啶银乳膏组)；D-F.7 d时间点(D为模型组，E为解毒生肌膏组，F为磺胺嘧啶银乳膏组)；G-I.21 d时间点(G为模型组，H为解毒生肌膏组，I为磺胺嘧啶银乳膏组)图5 3、7、21 d时间点各组大鼠溃疡创面TNF-α表达示意图(免疫组化染色 ×100)

3 讨论

糖尿病溃疡的发病机制尚不完全清楚，大量研究认为主要是由于体内高糖环境、氧化应激以及炎症反应等多种生物因素共同导致[7-9]，而炎症反应是其主要机制[10]。炎症反应是指致炎因子作用于机体后，引发组织细胞的损坏，使局部组织细胞显现变性、坏死的现象，同时诱发组织细胞产生抗炎反应维持局部平衡。而TNF-α、IL-6等为炎症反应中的主要炎症因子，是反应炎症水平的重要指标[11]。

表2 3、7、21d时间点各组大鼠溃疡创面TNF-α阳性表达量

创面愈合即皮肤在损伤后通过体内各种因子相互作用进行修复，是一种机体自我动员，主要包括凝血期、炎症期、增殖期、塑形期[17，18]，各期出现异常均可导致创面难愈。在持续高糖环境下，体内晚期糖基化终末产物(advanced glyclation end-products，AGEs)异常蓄积，与相应受体结合后触发炎症细胞产生IL-6、TNF-α等炎症因子，诱发炎症反应。大量研究发现，炎症反应可以引发氧化应激，如王文珊[12]证实炎症介质会刺激细胞，使之产生大量ROS，从而引起氧化应激。此外，炎症反应会引起局部微循环通透性增加，使微血管扩张，导致体液渗出和组织水肿；而大量炎症细胞瘀积会导致微循环局部栓塞，造成组织缺血坏死，使创面难以愈合[12-14]。综上所述，AGEs与其受体结合后，引发炎症、氧化应激、微循环障碍等一系列相互级联反应，其中炎症反应是导致糖尿病皮肤溃疡创面难愈的重要因素[15，16]。因此猜想，降低创面修复过程中炎症因子表达，以减轻炎症期反应、促进创面愈合是治疗糖尿病溃疡的关键。

解毒生肌膏是由全蝎、蜈蚣、乳香、没药按君臣佐使原则精密配伍制成，是本课题组指导老师经过长期临床实践研究总结的全新经验方。现代药理学研究表明，全蝎具有抗血栓形成、抑菌[19]、收缩血管[20]的作用，蜈蚣酸性水提液可以阻止真菌生长繁殖，乳香化合物136具有抗炎作用[21]，没药水煎剂(1∶2)中所含的丁香油酚可能有抗真菌作用，其他的一些活性成分对急慢性炎症都有抑制作用[22]。由此推断，解毒生肌膏具有抑制炎症反应、抗氧化、抗微血栓形成等药理作用[23-25]。

肉眼观察结果显示，解毒生肌膏组创面愈合速度明显加快，愈合面瘢痕较少。HE染色示，解毒生肌膏组表皮、真皮层水肿明显减轻，表皮结构层次清晰，成纤维细胞、胶原更丰富，新生毛囊等附属器增殖旺盛。免疫组化结果发现，在每个愈合时期，解毒生肌膏组和磺胺嘧啶银乳膏组与模型组比较，IL-6和TNF-α表达量均显著降低，其中解毒生肌膏组降低程度更大(P<0.05)，且解毒生肌膏组于造模后3 d其炎性细胞表达量提前达到峰值。研究结果证实，解毒生肌膏可降低炎症因子表达，加速溃疡愈合。

综上研究结果证实，中药解毒生肌膏可通过下调IL-6、TNF-α的表达减轻炎症，同时促进糖尿病创面愈合，提高愈合质量，但其具体机制仍需进一步深入研究。