外敷复方五凤草液对结核性溃疡患者创面愈合影响及作用机制研究❋

薛倩一，黄子慧，钱佳燕，洪练青

(南京中医药大学附属南京市中西医结合医院，南京 210014)

结核性溃疡是结核分枝杆菌侵犯机体局部组织，造成受侵或邻近皮肤及皮下软组织慢性坏死，最终导致皮肤破溃甚至形成窦道的一种临床常见的慢性难愈性创面疾病。其病程缠绵，创面不易愈合，或易形成假性愈合等，严重降低了患者的生活质量[1]。临床对于本病主要以基础抗结核治疗为主，但由于结核性溃疡创面周围血供破坏严重，全身性抗结核药在创面组织中难以达到有效杀菌浓度，导致局部疗效较差[2]，故而在结核性溃疡的治疗过程中，局部外治药物尤显重要。但目前临床上针对能显著促进结核性创面愈合且作用机制明确的外用药物研究较少，因此，寻找可纳入治疗结核性溃疡的药物是目前临床亟需解决的问题。

复方五凤草液由白及、猫爪草、泽漆(又名五凤草)组成，是南京市中西医结合医院瘰疬科研发的治疗结核性溃疡的经典名方，已在多年的临床和实验中取得了显著疗效[3，4]，但其临床作用机制仍不明确。有文献报道[5]，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在结核性溃疡患者血浆及肉芽组织中有高表达，TNF-α又激活下游炎症反应信号通路IL-1、IL-6、NF-κB等蛋白表达，使得创面呈现持续慢性炎症状态；同时，结核性溃疡患者血浆及肉芽组织中转化生长因子-β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子(PDGF)含量降低，肉芽组织和微小新生毛细血管的形成减慢，患者创面的愈合延迟。

因此，本文通过观察患者创面愈合情况，检测患者血浆及创面肉芽组织中TNF-α、TGF-β相关通路蛋白和细胞因子的转录及表达变化，对比镜下肉芽组织病理学改变，综合阐述复方五凤草液对结核性溃疡创面的愈合影响及其作用机制。本研究经南京中医药大学附属南京市中西医结合医院伦理委员会审查批准，批件号201901001，所有患者接受给药前均签署知情同意书。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018年12月至2019年12月南京市中西医结合医院瘰疬科收治入院的结核性溃疡患者为研究对象，且符合纳入标准。

1.2 诊断标准

西医诊断标准按照《现代结核病学》[8]和《常见疾病的诊断与疗效判定(标准)》制定[9]：脓肿破溃后脓液稀薄夹有败絮样物，疮口潜行，久不愈合，病理证实为结核，或脓液涂片找到抗酸结核杆菌，可有肺结核病史或肺结核接触史，伴有低热盗汗、神疲乏力、消瘦等全身症状。

中医证候诊断标准参考《中医外科学》第3版[23]瘰疬病辨证分型制定标准：选择气血两虚证患者，如局部创面脓水淋漓、肉色不鲜，肉芽组织颜色苍白，腐肉不脱，极难收口，形成空腔或窦道，经久不愈。患者神疲乏力，面色苍白，气短懒言，语声低微，常自汗，头晕目眩，心悸，舌质淡，苔薄白，脉细弱。

1.3 纳入标准

符合诊断标准(西医诊断标准以及中医证候诊断标准中的气血两虚证)；年龄 18～65岁；患者自愿接受本实验并签署知情同意书。

1.4 排除标准

合并有心脑血管、肝、肾和造血系统等严重原发性疾病、精神病患者、肿瘤或艾滋病患者；合并严重感染且病情危重患者;神经营养障碍者;妊娠或哺乳期妇女、过敏体质者;正在参加其他临床研究的受试者。

1.5 分组

将全部患者随机分为对照组和观察组，其中对照组 30 例，男11例，女19例，年龄 19～64岁，平均年龄(40.55±12.18)岁，病程 2～17个月，平均病程(5.32±2.89)个月，平均创面面积(6.43±2.18)cm2。观察组30 例，男 9例，女21例，年龄18～65岁，平均年龄(42.23±12.88)岁，病程 3～19个月，平均病程(5.65±2.21)个月，平均创面面积(5.91±2.33)cm2。2组患者性别、年龄、病程、创面面积等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.6 治疗

2组患者全部给予3HREZ/9HRE为代表的抗结核治疗方案,早期、联合、适量、规律、全程抗结核治疗。脓肿成熟自行破溃或切开引流后形成结核性溃疡，并予以局部换药。对照组根据溃疡面积及窦道深浅，剪取适当脱脂棉片，参考韩东等临床经验[10]采用康复新液(湖南科伦制药，国药准字Z180609)浸湿后外敷；观察组以复方五凤草药液浸湿的棉片外敷，隔日换药1次。

复方五凤草液制备：泽漆2000 g (大戟科草本植物泽漆EuphorbiahelioscopiaL.的地上部分，产自安徽，货号180320)，猫爪草400 g (毛茛科植物小毛茛Ranunculus ternatus Thunb.的干燥块根，产自河南，货号180416)、白及240 g (兰科植物白及Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.的干燥块茎，产自江西，货号180731)，由南京市中西医结合医院中药房提供。将以上诸药加水浸过药面煎煮3次，每次1 h，合并煎液滤过，药液浓缩分装制成复方五凤草液备用。所有药液均由南京市中西医结合医院中药制剂室制备提供。

1.7 疗效评价标准

参照《中医外科常见病诊疗指南》制定[11]，分为治愈、显效、有效、无效4级。治愈：局部症状明显改善，溃疡创面完全或基本愈合，积分减少>90% ;显效：局部症状明显改善，溃疡创面明显缩小局限，积分减少70% ～ 90% ;有效：局部症状好转，溃疡创面及病灶缩小，积分减少 30% ～ 69% ;无效：局部症状无明显改善甚或加重，积分减少<30%。愈显率(%)=(治愈例数+显效例数)/总例数×100%。

1.8 局部体征积分改善情况

结核性溃疡以其局部体征为观察指标，参考以往课题组量化标准[12]，重点观察局部溃疡创面的分泌物(形质、色泽、量)、腐肉(量、腐脱程度)、肉芽(色泽、量)、上皮组织(量)、窦道长短、创周(皮色、肿胀程度)等指标。按照各指标轻重程度分为 5 级，分别计0、1、2、3、4分。于给药前及给药后每周各观察记录 1 次，统计各时间点体征指标总积分情况。

1.9 ELISA检测血浆TGF-β、TNF-α，肉芽组织IL-1、IL-6、NF-κB、VEGF、PDGF的含量

在给药前和给药第1、2、4周分别抽取患者晨起空腹全血2 mL，在4 ℃低温2500 r/pm离心5 min。取上层血浆并在溃疡创面取少量肉芽组织-80 ℃冻存备用。实验时取适量血浆并匀浆肉芽组织，严格根据所测指标说明书要求进行标准品配置，加样(稀释1倍的样本)之后根据要求进行37 ℃恒温箱孵育，依次加入生物素化抗体工作液、酶结合物工作液、底物溶液、终止液等。在加入终止液后，立即用酶标仪(美国BioTek仪器有限公司,Victor3 plate reader)在450 nm波长处测量每个孔的光密度(OD值)。Human TNF-α ELISA Kit (E-EL-H0109c)，Human IL-1 ELISA Kit (E-EL-H0103c)；Human IL-6 ELISA Kit(E-EL-H0102c)；Human NF-κB ELISA Kit (E-EL-H1386c)，均购自伊莱瑞特生物科技公司；Human TGF-β ELISA Kit(JL20082-96T)、Human VEGF ELISA Kit(JL19608 -96T)、Human PDGF ELISA Kit (JL15347-96T)均购自江莱生物公司。

1.10 qPCR检测肉芽组织TGF-β、TNF-αmRNA表达

在给药前和给药第1、2、4周治疗后取创面少量肉芽组织于冻存管，-80 ℃冰箱保存待检。引物由上海捷瑞生物工程有限公司设计并合成,TGF-β(329bp)引物上游5′-CATCAACGGGTTCACTACC-3′,下游5′-CTCCGTGGAGCTGAAGCA -3′;TNF-α(169bp)引物上游5′-CGAGTCTGGGCAGGTCTA-3′,下游5′-GTGGTGGTCTTGTTGCTTAA-3′;β-肌动蛋白 (β-actin)；引物上游5′-TCAGGTCAT CACTAT CGGCAAT-3′,下游5′-AAAGAAAGGGTGTAAAA CGCA-3′。提取创面肉芽组织总RNA,检测总RNA的纯度、浓度及其完整性。总RNA提取后,反转录合成cDNA,采用PrimeScriptTMPT Master Mix (Perfect Real Time)试剂盒(Takara，RR036A),ChamQTMSYBR®qPCR Master Mix (Without ROX)试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，Q321-02)相应反应体系进行PCR反应。

1.11 创面大体观及组织病理学改变

患者在给药前和给药4周后比较患者创面大体观变化，同时在创面取新鲜肉芽组织标本，用10%多聚甲醛固定，经冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋后做常规石蜡切片，将切片脱蜡、复水、染色、脱水、透明、封藏后在 400 倍视野(德国徕卡微系统有限公司，DM3000显微镜)下观察创面肉芽组织病理学变化。

1.12 统计学方法

2 结果

2组均完成治疗研究，无不良事件发生，无脱落以及失访病例，全部病例进入统计分析。

2.1 2组临床疗效比较

表1示，观察组总体疗效明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 2组总有效率比较 [例(%)]

2.2 2组患者各时间点局部体征积分比较

表2示，与给药前比较，2组患者在给药后第1、2、4周局部体征积分均明显下降(P<0.05或P<0.01);与对照组比较，观察组治疗后第4周局部体征总积分下降更明显(P<0.01)。

表2 2组患者各时间点局部体征积分比较 (分值，

2.3 2组患者血浆TGF-β、TNF-α，肉芽组织IL-1、IL-6、NF-κB、VEGF、PDGF含量比较

表3、4示，给药前2组患者血浆TGF-β、TNF-α，肉芽组织中IL-1、IL-6、NF-κB、VEGF、PDGF的含量，差异无统计学意义(P>0.05)，治疗2周后对照组和观察组患者血浆TNF-α，肉芽组织中IL-1、IL-6、NF-κB含量减少，血浆TGF-β、肉芽组织VEGF、PDGF含量显著增加(P<0.05或P<0.01)。4周后与对照组比较，观察组疗效更明显，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

表3 2组患者各时间点血浆中细胞因子含量比较

表4 2组患者各时间点肉芽组织中细胞因子含量比较

2.4 2组患者肉芽组织TGF-β、TNF-α mRNA表达比较

表5示，比较给药前2组患者肉芽组织TGF-β、TNF-α mRNA表达，差异无统计学意义(P>0.05)。2周后各组患者肉芽组织TGF-β mRNA表达水平升高，TNF-α mRNA表达下降(P<0.01)；4周后与对照组比较，观察组患者肉芽组织TGF-β mRNA表达水平更高，TNF-α mRNA表达更低，差异有统计学意义(P<0.01)。

表5 2组患者不同时间点肉芽组织TGF-β、TNF-α mRNA表达比较

2.5 患者创面大体观及组织病理学改变

图1示，给药前患者创面肤色黯淡，存在大量坏死组织和败絮样脓性分泌物,创面及皮下脓肿包块明显；给药2周后，创面渗液及脓肿分泌物明显减少，皮下坏死组织形成的脓肿包块明显减小；外敷给药4周后，患者创面及其周围水肿均明显消退,患者创面结痂。

图1 干预给药前、给药2周/4周后观察组患者创面大体形态

图2示，给药前镜下可见大量类上皮细胞和朗罕氏巨细胞伴淋巴细胞、中性粒细胞等炎性细胞浸润,并伴微脓肿形成；给药2周后，仍可见部分类上皮细胞和朗罕氏巨细胞伴淋巴细胞、中性粒细胞等炎性细胞浸润；给药4周后，可见大量新生的毛细血管和胶原纤维伴少许组织细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润。

注：a.脓肿；b.朗罕氏巨噬细胞；c.炎性细胞；d.新生毛细血管；e.胶原纤维(HE×400)图2 给药前、给药2周/4周后观察组患者肉芽组织病理变化比较

3 讨论

结核性溃疡是肺外结核最为常见的疾病之一，主要见于淋巴结核、骨结核等病变中后期脓肿破溃后形成的创面，或可见于浅表皮肤创面，因病程中感染结核杆菌后形成的慢性难愈性溃疡。其具有创面不易愈合、病程缠绵、容易复发等特点，属于临床难治痼疾，给患者、社会、医疗体系造成巨大负担[13]。本病属于中医学“疮疡”范畴，多因患者素体正气亏虚、气血不足或阴虚火旺，又感邪毒痨虫，局部气血凝滞，郁而化热，蕴蒸酿脓，溃破脓出，淋漓不尽，导致“腐肉难去，新肉不生”，而形成慢性难愈性溃疡，致其发展为窦道、瘘管。《外科正宗·痈疽治法总论》云：“脓出方自腐脱，腐脱方自生肌，肌生方自收敛，收敛方自疮平。[24]”基于此理论，我科筛选名医经验良方，选取五凤草以行水消肿、杀虫解毒、祛腐生肌[14]；白及以收敛止血，消肿生肌；猫爪草以消肿散结，化痰解毒，3味药并用共奏提脓去腐、活血生肌之效[3]。

有研究表明，患者感染结核杆菌后全身免疫系统被激活，血清炎症因子TNF-α含量升高[22]，故本实验对不同时间点患者血浆进行了检测分析，以辅助检测结核病的治疗情况。同时对创面肉芽组织的观察、检测分析，是为研究复方五凤草对溃疡创面组织的直接作用。此外，本试验选择给药前、给药后1周、2周、4周作为临床观察时间点，能全面反映复方五凤草液在治疗各个阶段对创面的影响及作用机制。最终本实验证明，在给药2周后复方五凤草液就能显著改善患者局部体征积分，减少脓液分泌，加快腐肉脱落，促进健康新生肉芽生长和创面的愈合；给药4周后与康复新液比较，复方五凤草液能明显提高患者血浆TGF-β、TNF-α，肉芽组织IL-1、IL-6、NF-κB、VEGF、PDGF的含量，表明复方五凤草液能有效促进结核性溃疡患者创面的愈合，其作用机制可能与降低TNF-α通路相关蛋白表达水平，提高TGF-β相关生物因子的表达水平相关。

TNF-α是由巨噬细胞分泌的一种小分子蛋白，是伤口愈合的生物标志物之一。TNF-α的分泌进一步增加血管通透性,使补体等效应分子与效应细胞穿过血管壁到达感染部位,继而诱导下游IL-1、L-6及NF-κB等炎症因子的大量释放，而IL-1、L-6及NF-κB等炎症因子能促进中性粒细胞的氧化反应，使组织的炎症反应呈持续状态[18]。本次实验中，患者血浆和肉芽组织中TNF-α、IL-1、L-6及NF-κB等炎症因子表达，随给药时间的增加而逐渐降低，溃疡创面炎症状态逐渐改善，可见复方五凤草液具有一定的抗炎作用。

溃疡创面的愈合是一个复杂的过程，涉及细胞迁移和炎症，成纤维细胞增殖并形成肉芽组织和细胞外基质(ECM)沉积，以及瘢痕组织在较长时间内重塑[15]。TGF-β是生长和分化因子家族的原型，由哺乳动物中的33个基因编码，并包含同二聚体和异二聚体。已有大量文献报道了TGF-β通过对多种细胞类型的作用来调节这些不同的步骤，并在体内促进伤口愈合过程[16，17]。实际上，TGF-β可以通过吸引成纤维细胞和血小板到炎症和修复部位，高效诱导 ECM 蛋白的表达，并抑制ECM降解等方式介导创面的纤维化，强烈地促进体内创面的愈合[15]。本次临床实验中，在外敷复方五凤草液后创面肉芽组织中TGF-β的转录和翻译明显增加，并诱导角质蛋白细胞释放VEGF 因子，血小板释放PDCG因子，促进溃疡创面微血管和新鲜肉芽组织的形成，提高创面血供，加速创面愈合。

本实验结果表明，TNF-α和TGF-β在复方五凤草液促进结核性溃疡创面愈合过程中起到重要调节作用。在治疗期间较之对照组，观察组创面肉芽组织中TGF-β mRNA表达明显升高，TNF-α mRNA表达明显降低,表明复方五凤草液可提高创面肉芽组织TGF-β mRNA表达，并激活下游VEGF 因子和PDCG因子，以促进溃疡创面的愈合；同时可降低TNF-α mRNA表达，减少下游IL-1、L-6及NF-κB等炎症因子释放，以抑制溃疡创面的局部炎症反应。本课题组前期实验和文献表明，复方五凤草液中有大量的酚酸、黄酮类化合物[19]，其中没食子酸可抑制TNF-α的表达[20],金丝桃苷能促进TGF-β mRNA表达[21]。同时血浆TGF-β和TNF-α含量的变化趋势也与文献报道一致，对结核病的抑制有正向作用[7]。

综上，复方五凤草液可促进结核性溃疡创面的愈合，而TGF-β和TNF-α可从正负两个方面调控结核性溃疡的创面修复，可视为复方五凤草液促进结核性溃疡创面修复的机制之一。