种子果实类中药DNA条形码鉴定的研究进展

姜 波

随着中医药技术的发展，人们对中医中药的关注程度不断上升，中药的需求量也在不断增加。中药材的质量直接决定了中医治疗效果，中药质量对临床治疗至关重要[1]。传统草本记载差异和中药命名复杂、地域广阔有关，并且存在同物异名或同名异物的情况，还存在伪品和部分混淆的情况，导致中药市场混乱，各地区存在用药差异等问题，直接影响中药的稳定性和疗效性。对于中药材种子果实类品种通过DNA条形码技术鉴别，能够摆脱物种的外观形态特征和鉴别人员专业水平限制，更加客观地避免干扰和主观性影响，提高鉴定的准确性[2]。本文通过分析DNA条码鉴别种子果实类中药的研究进展，为中药准确鉴别研究提供参考和依据。

1 DNA条码鉴定技术

1.1 鉴定意义DNA条码技术于2003年首次提出，通过对中药材基源物种PCR增扩片段的分析，比对增扩产物序列情况，寻找DNA条码后再有目的的构建条码进行系统识别。DNA条码鉴别是通过较短的DNA序列进行物种鉴别，该种分子生物学鉴别方法被称为DNA条形码鉴定技术[3]。通过DNA条形码技术鉴别中药，可以建立健全DNA条形码数据库，确立标准化的DNA鉴定操作流程，以实现中药材分子生物学鉴定的标准化和自动化[4]。中药DNA条码鉴别主要意义在于：对传统中药鉴定方法作以补充，促进中药资源的利用和开发，弥补传统中药鉴定方法人才不足情况，保护中药资源生物多样性，寻找形态学难以确认的隐种，利于中药市场监督管理。

1.2 序列选择2009年国际会议确定将叶绿体中的2个基因片段作为植物鉴别的核心DNA条码，建议将核基因片段作为DNA条码的补充条码。相关研究表明在选择的900余个样品中，DNA条码能够鉴别出500余个品种，成功率高达70%以上[5]。2013年《中华人民共和国药典》增补本将中药DNA条形码分子鉴定指导原则，通过对大量中药进行DNA条码鉴定研究，并建立了条码鉴定体系，其中对动物类和植物类药材的DNA条形码体系进行确立。

1.3 序列选择标准DNA条形码序列图谱之间的鉴别，需要鉴别物种之间有较大的序列差异，在选择目标序列中应选择有种间序列差异较大或有变异位点的序列，利于物种之间的鉴别，种内和种间存在清晰界限。DNA序列两端应便于引物序列扩增和涉及；选择序列应尽可能简短便于DNA扩增。

2 DNA条码鉴定的应用

中药产业化进程的不断推进，中药材提取技术不断更新，中药材提取逐步工业化、规模化，导致中药材植物和动物的数量不断减少。中药材开发受到物种资源短缺或灭绝的限制，为了寻找更多具有药用价值的可代替传统中药材的生物资源，在中药鉴别方面便于寻找潜在资源物种，通过DNA条码测序构建系统发育关系，分析物种间遗传关系，利于发现分子水平上密切联系的物种，寻找可以代替的潜在资源。研究显示，通过10批样本进行DNA条形码鉴别，能将2批次混入的其他物种准确鉴别[6]。

3 DNA条码鉴别方法及注意事项

3.1 方法先对被鉴别物种进行样本采集，先进行DNA提取和对PCR扩增的测序工作，根据测序结果进行分析，寻找被鉴别种属的对应DNA序列[7]。挑选饱满的种子果实，提取总DNA，取样本0.3 g，用双氧水浸泡30 min，用蒸馏水冲洗数次，在紫外灯光下照射15 min，除去外源的DNA，用石英砂冰浴研磨，预热后取缓冲液2 ml，在水域中振摇提取，高速离心，上清液加入醋酸钾溶液，倒入离心管中加入氯仿-异戊醇混均，反复颠倒后离心，再重复以上操作，离心后去掉乙醇，将溶液倒在吸水纸上用风机吹干，用冷冻冰箱保存。

3.2 注意事项在DNA采集和测序工作中，应注意细节操作，避免样品携带的污染，在取样时避免交叉污染，试剂污染，操作人员污染等[8]。对于洁净度要求高的操作步骤应在超净工作台内操作。做好试验记录，出现问题或偏差后及时查找原因。实验人员在操作中应佩戴口罩、手套，穿戴好隔离服。按照试剂使用说明要求进行操作，对于有毒、有害试剂应做好人身保护。排查数据处理实验中各种干扰因素、仪器设备误差等原因，以保证实验的严谨性和准确性。

3.3 实例分析种子类药材菟丝子的近缘物种多达45份，按照207条ITS2序列构建菟丝子的DNA条形码数据库，结合克隆测序，对从药材市场、医院、药店购买的菟丝子药材进行鉴别。结果发现70%市面销售的菟丝子药材存在混伪情况[9]。混伪的物种包括埃塞俄比亚芥、茴香、大头菜、大豆、日本菟丝子、紫苜蓿等。说明采用DNA条形码鉴定种子果实类药材和市场监督均有较好作用。

4 DNA条码鉴别存在的问题

采用DNA条形码技术鉴别的前提为确定需要鉴别的中药基原的真伪品是否进化完全，只有进化完全的样本才能进行该种方法的鉴别，在此基础上再进行DNA条码鉴别，结果会相对客观。在鉴别植物DNA时，多采用新鲜植物叶片作为样本，经过炮制或加工过的中药饮片则无法进行DNA鉴别，结果回收到DNA断裂或降解的影响，需要进一步实践[10]。中药DNA条码鉴别中难以获得完整的模板，在采集、贮藏过程中中药样本会因很多条件变换发生简介，导致能够检测的DNA片段较小。因自身的局限性不能对矿物质药材进行鉴别，不能在所有中药中施展，应与传统鉴定方法相结合，单纯使用DNA条形码鉴别技术不能保证中药鉴别的全面性和准确性。

5 DNA条码鉴别解决方案

在采集和存放样本过程中应严格按照规范要求进行操作，避免因外界环境影响，使样本种的DNA发生降解或遭到破坏。植物样本应尽量采集新鲜叶片，保证完整序列和扩增模板。加强基因组的测序研究，对基因组资料进行丰富，以选择更小的基因片段[11]。动植物分类学中DNA条码鉴别技术较成熟，中药材鉴别应用较广泛，为质量监管提供新方法。

6 前景展望

虽然2003年就提出了DNA条形码理论，并且在动植物鉴别方面有显著成效。但DNA条码鉴别技术还多停留在实验研究阶段，不能单独走出实验室，需要通过现代化的电子设备进行生物鉴别。设备上的要求给DNA条形码鉴定技术的应用推广提出挑战，不能广泛应用在中药材鉴别上，样本的要求不能将DNA条形码鉴定技术应用在中成药的鉴别中。但随着鉴别技术研究的不断深入，某些研究已经从人参中药中提取到DNA，并能成功扩增核糖体序列，已完成人参混伪品的鉴别[12]。随着DNA序列码数据库的逐步建立，将二维码作为DNA序列信息的载体，通过扫描二维码信息实现中药鉴别的信息化[13]。不断完成中药质量评价标准，必将使DNA条码技术发挥出智能、快捷、可靠的鉴别作用。希望不久的将来，中成药真伪鉴别也能通过DNA条形码完成。

7 小结

DNA条形码鉴定技术可以摆脱中药动植物物种形态特征、操作者水平、动植物生长阶段等限制，提高鉴定的准确性和通用性[14]。将10个碱基组成的任意序列核苷酸片段进行基因组PCR扩张，以判断多态性DNA的结合位点，以判断该区域序列发生基因突变、片段插入、缺失情况引发的分子量变化，转变为多态DNA片段[15]。通过对同属不同种种子果实类中药根尖体染色体、蛋白质DNA条形码特征研究，结果说明混淆品和正品存在特征区别。通过DNA技术鉴别不同种种子果实类中药提供了理论依据，同时建立了动植物关系为分类学研究奠定基础。通过中药基原鉴定和质量评价，研发便携式设备，使DNA条形码鉴定技术得到普及扩大使用范围。DNA条形码技术可与更多的科学技术联合使用，以改善应用的不足和局限性，有效促进中药产业现代化及规模化。