小菜蛾成虫喙管感器的超微结构及其神经元中枢投射

闫喜中,谢佼昕,邓彩萍,郝 赤,*

(1.山西农业大学植物保护学院,山西太谷 030801;2.山西农业大学林学院,山西太谷 030801)

口器是昆虫的取食器官，由于昆虫摄食习性和取食方式不同，口器在形态和结构上也有差异。虹吸口器是鳞翅目成虫特有的取食器官，其喙管由外颚叶延长并连锁形成。喙管的顶端具有可吸入液体的裂缝，占整个喙管长度的5%～20% (Paulus and Krenn,1996;Krennetal.,2001;Petr and Stewart,2004)。通过头部肌肉的节律性收缩来吸入液体食物，如花蜜、水、动物血液、汗液、眼泪和尿液等(Krenn and Penz,1998;Krenn,2010;Monaenkovaetal.,2012;Lehnertetal.,2015)。

喙管上分布有大量的感器，在昆虫觅食、识别寄主和选择产卵部位等方面起着重要的作用。对喙管上感器的研究主要集中在蝶类(Paulus and Krenn,1996;Krenn,1998;Krenn and Penz,1998;Krennetal.,2001;Krenn and Bauder,2018;Maetal.,2019)及夜蛾科(Noctuidae)(Zaspeletal.,2011;王娜等,2012;Xue and Hua,2014;Guoetal.,2018)、卷蛾科(Tortricidae)(Waltersetal.,1998)、螟蛾科(Pyralidae)(Faucheux,1991;Barcaba and Krenn,2015)等蛾类上。喙管上的味觉感器在摄食过程中发挥了重要作用(Bray and Amrein,2003)。味觉感器最多含有5个不同功能的感觉神经元，其中包括1个机械感受神经元和最多4个味觉受体神经元(Ozakietal.,2003;Masalaetal.,2009)。西方蜜蜂Apismellifera(Rehder,1989)和烟芽夜蛾Heliothisvirescens(Jørgensenetal.,2006;Kvelloetal.,2006)口器的感器神经元均投射在脑部的咽下神经节。咽下神经节被认为是味觉感器的初级处理中心(Rajashekhar and Singh,1994;Miyazaki and Ito,2010)。昆虫中枢神经系统通过对味觉信息进行编码，进而调控不同反应的摄食行为。因此，明确昆虫味觉系统的神经通路尤为重要。

小菜蛾Plutellaxylostella属鳞翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae)，是十字花科蔬菜的重要害虫之一，每年给世界经济造成40～50亿美元的损失(Furlongetal.,2013)。目前对小菜蛾的分布、生活史和寄主范围已有较多报道(Sarfrazetal.,2005)，但成虫的取食行为等方面的研究较少，尤其是喙管感器的种类及神经元投射还未报道。本实验利用扫描电镜和神经元示踪剂技术研究了小菜蛾成虫喙管上感器的超微结构及其神经元在脑部的投射，为将来研究喙管感器生物学功能或利用调控取食行为对小菜蛾种群进行防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 虫源及饲养方法

小菜蛾在山西农业大学昆虫神经行为和感官生物学实验室的人工气候箱内饲养(饲养条件为温度25℃，相对湿度75%，光周期14L∶10D)。

1.2 小菜蛾喙管感器的扫描电镜观察

分别选取羽化2-3 d的雌、雄小菜蛾成虫各10头，用乙醚麻醉后，在解剖镜下用手术刀剪下喙管并浸于2.5%的戊二醛固定液中，4℃冰箱过夜。用PBS冲洗喙管3次，每次10 min，依次用30%,50%,70%,80%,90%和95%乙醇梯度脱水各10 min，用100%的乙醇脱水2 次，每次10 min，最后用纯叔丁醇置换30～40 min。叔丁醇冷冻干燥2～4 h。将干燥后的组织结构用双面胶固定在扫描电镜的样品台上，离子溅射仪喷金，在S-3400N扫描电子显微镜(日本日立公司)下观察并拍照。电镜工作电压10 kV。

1.3 小菜蛾喙管感器神经元回填

将小菜蛾成虫装入切去顶部的白色枪头并露出头，用双面胶将触角粘在载玻片上，使小菜蛾头部固定不动，在解剖镜下用小剪刀将喙管基部切断，然后在切口处滴一滴蒸馏水。10 min后，清理掉剩余的蒸馏水，将填充有2% NeurobiotinTM488溶液的玻璃毛细管套在喙管的切割处。然后将它们放置在加湿的培养皿中，并于 4℃在黑暗条件下放置1 h。

1.4 激光共聚焦观察小菜蛾脑组织

将回填好的小菜蛾在解剖镜下用手术剪刀将头部剪下迅速浸入4%多聚甲醛固定液里，再用精细剪刀将小菜蛾的背侧脑壳轻轻剪开，将完整的脑部轻轻剥离出来，将脑组织置于4%多聚甲醛固定液中4℃过夜。将固定好的脑组织用0.1 mol/L PBS洗涤3次，每次10 min。脑部组织在2 μg/mL Alexa 488 Streptavidin溶液浸泡1～2 d后，用一系列梯度浓度酒精脱水:30%,50%,75%和95%酒精各10 min，100%酒精10 min并重复2次。然后二甲苯洗涤2次，每次5 min，将脑部组织放入载玻片凹槽内并正面定位脑部组织，用中性树脂Dibutylphthalate Polystyrene Xylene进行封片。用激发光波长为488 nm的激光共聚焦显微镜对小菜蛾的脑部进行分层扫描。

1.5 数据分析

获得的图片均在Adobe Photoshop CS5软件中编辑；利用软件ImageJ分别测量小菜蛾成虫喙管不同种类感器的长度、宽度，使用SPSS软件分析参数的雌雄二型差异。

2 结果

2.1 小菜蛾喙管的结构

小菜蛾成虫喙管长度大约是体长的一半(图1:A)，它由两个细长卷曲的外颚叶链锁形成一个食物管。喙管可分为近端，弯曲，远端和尖端区域。在不取食或休息时，小菜蛾成虫喙管卷曲形成3～4个圆圈，并位于头下方的两个下唇须之间。喙管的外表面呈凹陷状，分布大量的感器(图1:B;图3:A)。

2.2 小菜蛾喙管感器类型和分布

小菜蛾成虫喙管上存在毛形感器(两种亚型)、腔锥形感器、锥形感器、刺形感器和栓锥形感器5种不同类型的感器。

2.2.1毛形感器：毛形感器位于小菜蛾喙管外侧，基部稍粗，顶端纤细，表面光滑无孔(图1:B-D)。根据其长度可分为由两种亚型：毛形感器Ⅰ型和毛形感器Ⅱ型，毛形感器Ⅰ型多分布于喙管外侧中部(图1:B,C)，毛形感器Ⅱ型多分布于毛形感器Ⅰ型与喙管的齿钩之间，随机排列4～6排(图1:D)。毛形感器Ⅰ型在雌性和雄性小菜蛾喙管上的平均长度分别为为12.88±1.94 μm 和12.90±2.04 μm，基部的平均宽度分别为0.70±0.13 μm和0.70±0.16 μm；毛形感器Ⅱ型比Ⅰ型要短，在雌性和雄性喙管上的平均长度分别为4.26±0.57 μm和4.22±0.64 μm，基部的平均宽度分别为0.52±0.09 μm和0.50±0.10 μm(表1)。

图1 小菜蛾成虫喙管上毛形感器的扫描电镜观察Fig.1 SEM photomicrographs of sensilla trichodea on the proboscis of Plutella xylostella adultsA:喙管的外颚叶和下唇须结构Structure of the galeae of proboscis and labial palp;B:外颚叶基部的毛形感器Ⅰ和Ⅱ The proximal region of Ga with sensilla trichodea subtype Ⅰ (STⅠ)and Ⅱ (STⅡ)；C:毛形感器Ⅰ的放大图Close-up of the sensilla trichodea subtype Ⅰ;D:毛形感器Ⅱ的放大图Close-up of the sensilla trichodea subtype Ⅱ.Ga:外颚叶Galea;LP:下唇须Labial palpus.

表1 小菜蛾成虫喙管上不同感器的类型及大小Table 1 Types and dimensions of the sensilla on the proboscis of Plutella xylostella adults

2.2.2锥形感器：锥形感器主要分布于小菜蛾喙管外表面且不规则排成4～5列，感器锥体较直，基部宽顶端较细，插入圆形基座中，有些锥形感器表面光滑但顶部有沟状小孔(图2:A,B)，有些表面不光滑但顶端有点状小孔(图2:C,D)，有些表面则具有密集小孔(图2:E,F)。这种感器从喙管基部到顶端均有分布，且长度逐渐变短，在雌性和雄性小菜蛾喙管上的平均长度分别为8.39±1.5 μm和6.59±1.08 μm，基部的平均宽度分别为1.08±0.12 μm和1.19±0.14 μm，经t检验结果表明，雌性喙管上的锥形感器显著长于雄性喙管上的锥形感器(表1)。

图2 小菜蛾成虫喙管上不同外形锥形感器的扫描电镜观察Fig.2 SEM photomicrographs of different shapes of sensilla basiconica on the proboscis of Plutella xylostella adultsA:表面光滑顶部有孔的锥形感器Sensilla basiconica have smooth surface with pores at the top;B:A图中感器顶部的放大图Close-up of the top of sensilla basiconica in Fig.A;C:表面不光滑顶部有孔的锥形感器Sensilla basiconica have rough surface with pores at the top;D:C图中感器顶部的放大图Close-up of the top of sensilla basiconica in Fig.C;E:表面有密集小孔的锥形感器Sensilla basiconica with dense pores on the surface;F:E图中感器顶部的放大图Close-up of the top of sensilla basiconica in Fig.E.P:孔Pore;S:基座Socket.

2.2.3腔锥形感器：腔锥形感器分布于小菜蛾喙管食道内壁上且排成一列，感器基窝下陷，并着生出一个感觉锥，表面不光滑有凸起皱纹，感觉锥无孔，顶部有一个乳头状突起(图3)；在雌性和雄性小菜蛾喙管上的平均长度分别为1.93±0.54 μm和2.11±0.44 μm，基部的平均宽度分别为1.05±0.16 μm和1.02±0.14 μm(表1)。

图3 小菜蛾成虫喙管上腔锥形感器的扫描电镜观察Fig.3 SEM photomicrographs of sensilla coeloconica on the proboscis of Plutella xylostella adultsA:食道内侧的腔锥形感器Sensilla coeloconica (Co)in the internal food canal;B,C:腔锥形感器的放大图Close-up of the internal sensilla coeloconica.

2.2.4刺形感器：刺形感器在外形上与毛形感器有点相似，但是刺形感器不弯曲，着生于圆台底座上，基部宽大，末端尖细，与喙管呈一定角度直立且表面无孔但具有凹槽(图4:A,B)。刺形感器分布于喙管外表面，在雌性小菜蛾喙管上的平均长度为14.47±4.49 μm，基部的平均宽度为0.95±0.10 μm，而雄性的锥形感器平均长度为15.43±3.91 μm，基部的平均宽度为1.07±0.15 μm (表1)。

2.2.5栓锥形感器：栓锥形感器是鳞翅目昆虫喙管上最典型的感受器类型，仅分布在喙管的顶端。小菜蛾成虫每个外颚叶上有3～5个栓锥形感器(图4:C)，这类感器的基座较长并且有4个棱，在基座中上部每个棱会向上延伸一段刺状结构，基座顶部凹陷并伸出一个圆锥体状感觉椎，长度较短且表面光滑(图4:D)。栓锥形感器在雌性和雄性小菜蛾喙管上的平均长度分别为8.94±0.33 μm和7.98±0.27 μm，基部的平均宽度分别为2.92±0.16 μm和2.29±0.10 μm，经t检验结果表明，雌性的栓锥形感器明显长于雄性的(表1)。

图4 小菜蛾成虫喙管上刺形和栓锥形感器的扫描电镜观察Fig.4 SEM photomicrographs of sensilla chaetica and styloconica on the proboscis of Plutella xylostella adultsA:喙管外侧的刺形感器Sensilla chaetica on the outside of proboscis;B:刺形感器Sensilla chaetica (SCh);C:喙管顶端成簇的栓锥形感器Sensilla styloconica in cluster on the tip of the proboscis;D:栓锥形感器Sensilla styloconica (SS).Pi:刺Pike;S:基座Socket;SC:感觉锥Sensory cone.

2.3 小菜蛾喙管感器神经元投射

利用激光共聚焦扫描显微镜观察小菜蛾脑部，可以清楚地看到触角叶、咽下神经节和咽喉等结构。咽喉位于脑部中间，两边对称地分布着一对触角叶，下方为咽下神经节。从喙管基部切断并对其上所有的感觉神经元和运动神经元进行神经回填，结果发现传入神经仅投射到脑部咽下神经节部位，其他如触角叶等部位均未发现神经投射(图5:A)。喙管由两条外颚叶组成，每条外颚叶上的感觉神经元主要投射在其同侧的咽下神经节部位，神经纤维束进入咽下神经节后立马出现很多分支，形似树根(图5:B)。喙管感器和运动的神经元主要投射到3个区域：大部分神经纤维投射到咽下神经节的后侧，一部分神经纤维投射到咽下神经节的中央区域，并与另一根外颚叶的神经重叠(图5:C)，少量的神经纤维投射到咽下神经节的顶部，接近于触角叶的正下方(图5:D)。喙管肌肉运动神经元包括两对胞体，分别位于咽下神经节的两侧(图4)。

图5 小菜蛾成虫喙管投射神经在脑部的空间分布形态Fig.5 Projections of neurons from proboscis in the brain of Plutella xylostella adultsA:正面视图Frontal view;B:局部放大视图Partial enlarged view;C:腹面视图Ventral view;D:侧面视图Lateral view.箭头加1个星号表示神经末梢在咽下神经节中部的重叠区,箭头加2个星号表示神经末梢投射到咽下神经节的后侧，箭头加3个星号表示神经末梢投射到咽下神经节的上方，靠近于触角叶的正下方。The arrow with an asterisk indicates neurites overlapping area in the middle of SOG,the arrow with two asterisks indicates neurites projecting into posterior side of SOG,and the arrow with three asterisks indicates neurites projecting into the upper part of SOG and below AL.a:前面Anterior;AL:触角叶Antennal lobe;d:背面Dorsal;l:左面Left;N:神经纤维束Neurites;PL:咽喉Pharynx and larynx;p:后面Posterior;r:右面Right;So:胞体Soma;SOG:咽下神经节Suboesophageal ganglion;v:腹面Ventral.

3 讨论

喙管在鳞翅目有喙亚目昆虫的生存中起着非常重要的作用，在其成虫阶段通过两个延长的外颚叶链锁形成喙管吸食液体食物(Krenn,2010)。与访花昆虫如蝶类等相比，作为非访花蛾类的小菜蛾喙管长度比身体要短，但喙管上同样存在各种类型的感器，通过电镜观察发现了毛形感器(两种亚型)、腔锥形感器、锥形感器、刺形感器和栓锥形感器5种不同类型的感器，而且这些感器雌、雄性小菜蛾的喙管均存在，这可能与雌性和雄性小菜蛾成虫的取食习性相似有关。

小菜蛾的毛形感器位于喙管外侧，根据大小可分为由两种亚型(图1)。这些感器表面光滑无孔，是鳞翅目昆虫喙管上最常见的一类感器类型。在印度谷螟Plodiainterpunctella(Barcaba and Krenn,2015)和小红蛱蝶Vanessacardui(Krennetal.,2005)喙管上的毛形感器与小菜蛾的相似。根据超微结构推测小菜蛾喙管毛形感器的生物学功能可能与感知机械运动有关(Krenn,1998)。

锥形感器分布于小菜蛾成虫喙管的外表面(图2)。锥形感器在喙管外表面呈不规则排列，由一个短圆基座和插入其中的感觉锥组成，感觉锥的表面可能有不同数量的孔；该类感器也发现于欧洲向日葵螟Homoeosomanebulella(Faucheux,1991)、柑橘凤蝶Papilioxuthus(Inoueetal.,2009)、棉铃虫Helicoverpaarmigera(Guoetal.,2018)等鳞翅目昆虫的喙管上，它们被认为是化学感器和/或机械感器，Krenn (1998)认为这种感器具有味觉功能，电生理测试也显示锥形感器对蔗糖溶液有反应(Inoueetal.,2009)。

腔锥形感器分布于喙管食道内壁且仅有1列，其感器长度比锥形感器短，表面不光滑有凸起皱纹，感觉锥无孔(图3)。印度谷螟P.punctella喙管内腔锥形感器顶端有孔(Barcaba and Krenn,2015)，推测小菜蛾喙管腔锥形感器功能可能有别于印度谷螟，不具备化学感受功能，可能属于一种机械感器。位于食道内壁上的腔锥形感器可以感知吸入液体流速等信息(Krenn,1998)。刺形感器被认为是鳞翅目昆虫喙管上最长的感器类型，并且只分布在喙管的外表面，这些感器表面无孔，被认为是机械类感器(Krenn,1998)。该类感器也发现于茱莉亚蝶Dryasjulia,带条状橙色蝴蝶Dryadulaphaetusa和袖蝶属Heliconius等昆虫的喙管中，且刺形感器长度都比小菜蛾的长，且前两种蝴蝶的刺形感器都集中在其喙管的基部(Krenn and Penz,1998)。基于鳞翅目昆虫的取食行为，Krenn等(2001)认为刺形感器可以检测花的直径和花冠的深度。为了防止在取食过程中受到干扰，刺形感器的长度从喙管基部到尖端逐渐变短(Krenn,1998,2010;Krenn and Penz,1998;Krennetal.,2005;Mollemanetal.,2005)。

栓锥形感器是鳞翅目昆虫喙管上最具代表性和研究最多的一类感器类型(Kreen,1998)，它被认为是由锥形感器进化而来(Faucheux,1991)。小菜蛾喙管上的栓锥形感器不规则地分布于喙管顶端区域(图4)，且基座上有4个棱，这与印度谷螟P.punctella栓锥形感器的特征相似(Barcaba and Krenn,2015)，棉铃虫H.armigera(Guoetal.,2018)和烟青虫Helicoverpaassulta(王娜等,2012),茶银尺蠖Scopulasubpunctaria和灰茶尺蠖Ectropisgrisescens(张方梅等,2019)以及多种蝴蝶(Maetal.,2019)的喙管顶端也分布有栓锥形感器，但栓锥形感器外形与小菜蛾相比有差异，棉铃虫、烟青虫、茶银尺蠖和灰茶尺蠖这种感器的基座均有具有6个棱，银纹夜蛾Argyrogrammaagnata(王娜等,2012)及直纹稻弄蝶Pararaguttata和苎麻珍蝶Acraeaissoria等多种蝴蝶(Maetal.,2019)栓锥形感器的基座表面光滑，无棱。鳞翅目昆虫喙管栓锥形感器的功能可能是感受化学刺激或同时感受化学和机械刺激(Waltersetal.,1998;Nagnan-Le Meillouretal.,2000)，它对特定的单糖、多糖物质具有敏感性(Krenn,2010)。在以发酵水果为食的蝴蝶中，喙管栓锥形感器不仅对糖有反应，对乙醇也有反应(muraetal.,2008)。昆虫在取食时，喙管栓锥形感器可以感知花蜜在花中的确切位置，而且喙管尖端可以伸入花管的底部，这使得昆虫更容易地获取食物的信息(Krenn,1998)。

从小菜蛾喙管基部切断并对其进行神经回填，这样可获得喙管上所有感器神经纤维投射分布情况。通过感器神经元的投射可以反映其生物学功能，栓锥形感器是喙管上最具有代表性且研究最深入的感器类型(Krenn,1998)，Kvello等(2006)对烟芽夜蛾喙管上栓锥形感器进行回填，发现它的神经的走向为经过下颚神经节然后进入咽下神经节。在一些非鳞翅目昆虫中也有报道味觉感受神经元的轴突进入咽下神经节，在西方蜜蜂中，喙管上的味觉受体神经元投射到咽下神经节/后脑的下颚神经元节(Rehder,1989)。咽下神经节是初级味觉处理中心(Miyazaki and Ito,2010)，大部分机械感觉神经元也投射到咽下神经节(Rehder,1989)。本研究结果显示(图5)，小菜蛾喙管上所有的感觉神经元和供给摄食肌的运动神经元仅投射到咽下神经节，未发现有投射到触角叶的神经元，由此推测喙管上的感器为味觉感器或机械感器或味觉机械双功能感器，不存在嗅觉功能的感器。下一步可以从分子、电生理和神经回填等技术来确定小菜蛾喙管上不同感器具体的生物学功能，从而为利用调控小菜蛾成虫的取食行为来对其进行防治提供一定的科学依据。