11种常用农药对地熊蜂工蜂的毒性和风险评估

王宏栋,韩 冰,王玉赛,韩 双,王汝明,李冬刚,*

(1.德州市农业科学研究院,山东德州 253015;2.德州市农业农村事业发展中心,山东德州 253000)

我国大中拱棚以上的设施面积达370万hm2，居世界第一，约占世界设施农业总面积的80%，其中设施蔬菜播种面积400万hm2，占蔬菜播种面积的17%(骆飞等,2020)。随着设施蔬菜产业的迅速发展，设施作物对蜂类授粉的依赖和需求日渐增加，这是由于设施农业封闭或半封闭的环境，阻碍了传粉昆虫的进入，蔬菜在开花期间得不到充足的授粉，造成坐果率低、畸形果多等问题，直接影响了产量和品质，传统的人工授粉和激素蘸花不仅增加劳动强度，而且授粉效果不理想，还会造成激素残留，因此，设施农作物授粉难已经成为困扰当前设施农业发展的一个巨大难题(付宝春和杨蛟峰,2014)。

地熊蜂Bombusterrestris属膜翅目(Hymenoptera)蜜蜂总科(Apoidea)蜜蜂科(Apidae)熊蜂属Bombus，是一类多食性社会性昆虫，是多种植物，尤其是茄科和豆科植物的重要授粉者(魏梦宇和王星,2017)。我国是全世界熊蜂物种资源最丰富的国家，根据已有的文献资料，我国已探明的熊蜂有125种，这为国内熊蜂良种的筛选奠定了坚实基础(徐希莲和王欢,2018)。目前，在国外熊蜂授粉蜂群作为商品已经实现了出口创汇，达到了产业化水平。我国于20世纪90年代开始对熊蜂种质资源进行调查和筛选工作，熊蜂人工繁殖的研究和授粉应用示范已有20年，熊蜂授粉技术因其具有节省人工、提升果实产量和品质、减少环境污染和药物残留等优势(Daganetal.,2004;Polaszek,2010)，已成为我国设施农业实现设施作物优质、高效、高产的一项重要配套技术措施(周进等,2017)。

与此同时，设施蔬菜产业的迅速发展也给病虫提供了适宜的生长、繁殖和危害作物的生态环境。尤其是，各类植食性有害生物如蚜虫、蓟马、粉虱、叶螨等的危害不断加剧，造成极大的经济损失(雷仲仁等,2016)。由于蔬菜生长周期较短，病虫害的发生种类多、危害重，农业生产上不得不使用农药进行防治(田毓起,2000)。然而农药长期大量使用，不可避免地会对授粉昆虫造成一定的伤害，如蜜蜂长时间暴露在残留化学物质中会表现出反应迟钝、运动不协调、震颤等中毒现象，甚至寿命缩短，造成蜂群数量减少，影响授粉的效果(Oldroyd,2007;史晶亮等,2019)。

目前国内关于不同农药对蜜蜂属Apis的急性毒性研究较多，而作为全球范围内研究和商业化应用最为成熟的地熊蜂，对其关注不够，相关毒性研究比较少，并且还忽视了杀菌剂的毒性，仅仅评价了部分新烟碱类、植物源类和昆虫生长调节剂类杀虫剂对地熊蜂的生态风险性(王烁等,2020a,2020b,2020c)。单一种类杀虫剂在长时间使用过程中会导致害虫在选择压力下产生抗药性，因此选择不同种类的药物，尤其是轮换使用不同化学结构和不同作用机理的杀虫剂就显得尤为重要。因此，本研究根据杀虫剂的作用机理和化学结构，从不同类型挑选11种农业常用的杀虫剂、杀螨剂和杀菌剂农药作为待试药剂，采用经口毒性和接触毒性两种方法探究了11种农药对地熊蜂工蜂的毒性，并利用危害熵值评估其对地熊蜂工蜂的生态风险，以期为设施蔬菜熊蜂授粉期间合理选择农药提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

供试蜂种为地熊蜂B.terrestris工蜂，购自山东鲁保科技开发有限公司，于温度25±2℃、相对湿度60%±10%、黑暗条件下进行饲养，饲养过程未接触化学农药和试剂。试验所用地熊蜂均为个体大小基本一致的健康成年采集工蜂。

1.2 供试药剂

供试药剂为10%虫螨腈悬浮剂(广东省佛山市盈辉作物科学有限公司)、2.5%高效氯氟氰菊酯水乳剂(青岛星牌作物科学有限公司)、17%氟吡呋喃酮可溶液剂[拜耳作物科学(中国)有限公司]、22.4%螺虫乙酯悬浮剂[拜耳作物科学(中国)有限公司]、20%异丙威乳油(河南省安阳市五星农药厂)、20%除虫脲悬浮剂(河北威远生物化工有限公司)、20%丁氟螨酯悬浮剂(江苏省苏州富美实植物保护剂有限公司)、5%唑螨酯悬浮剂(福建省德盛生物工程有限责任公司)、43%联苯肼酯悬浮剂(爱利思达生物化学品有限公司)、2%春雷霉素水剂(日本北兴化学工业株式会社)、50%啶酰菌胺水分散粒剂(巴斯夫欧洲公司)。

1.3 农药对熊蜂的毒力测定

参考我国《化学农药环境安全评价试验准则.第10部分:蜜蜂急性毒性试验》(袁善奎等,2014)，根据半数致死剂量(median lethal dose,LD50)(48 h)将农药对熊蜂的毒性划分4个等级(以有效成分计)：低毒(LD50>11.0 μg a.i./蜂)；中毒(2.0 μg a.i./蜂

1.3.1急性经口毒性：参照《化学农药环境安全评价试验准则.第10部分:蜜蜂急性毒性试验》(袁善奎等,2014)，将待试药剂母液，用50%的蔗糖水溶液稀释成5个浓度梯度，为保证试验体系中有效成分均匀分散，所有系列浓度稀释液均使用超声波助溶。按每头蜂取食20 μL的量在饲喂器中加入不同浓度的药剂糖水溶液200 μL，将饥饿处理2 h的成年工蜂移入蜂笼，每个蜂笼10头成蜂，每个处理重复3次，并设50%蔗糖水为空白对照。饲喂3 h待药剂消耗完后添加充足50%蔗糖水继续饲养，记录24 h和48 h熊蜂工蜂死亡数，计算熊蜂工蜂的死亡率。

1.3.2急性接触毒性：参照《化学农药环境安全评价试验准则.第10部分:蜜蜂急性毒性试验》(袁善奎等,2014)，用丙酮或蒸馏水配置的母液稀释成5个浓度梯度。用微量点滴仪将不同浓度的供试药剂按每头蜂2 μL点滴在用CO2麻醉后熊蜂的中胸背板上，待蜂身晾干后转入蜂笼中，用充足的50%蔗糖水饲喂，每个蜂笼10头成蜂，每个处理重复3次，并设丙酮溶剂为空白对照。记录24 h和48 h熊蜂工蜂死亡数，计算熊蜂工蜂的死亡率。

1.3.3质量控制条件：参照周新等(2008)，设置上限剂量500 μg a.i./蜂，即在此条件下，未见熊蜂死亡，则不再进行毒力测定；若试验药剂溶解度小于500 μg a.i./蜂，则采用最大溶解度作为上限浓度；如在较高剂量试验药剂下，熊蜂拒绝采食，或是采食量很小，则最多将试验时间延长至6 h，并测定试验药剂残存量(即测定该处理的食物残存的体积)，用蔗糖溶液将剩余药物溶液替换掉。

1.3.4风险评估：农药对熊蜂的风险评估参照欧洲和地中海植物保护组织所采用的危害熵(hazard quotient,HQ)值(EPPO,2000;王烁等,2020c)。HQ值为农药田间推荐用量(AR)(g a.i./hm2)与农药对熊蜂急性经口或接触LD50(μg a.i./蜂)值的比值：HQ=AR/LD50。HQ>2 500，高风险；501时，风险不可接受。本研究分别采用饲喂法和接触法测得的48 h的LD50计算HQ和RQsp值，田间推荐剂量按照已在我国农业部登记的同一有效成分田间推荐用量的最大范围来计算。

1.3.5中毒症状观察：急性经口和急性接触试验期间，需保证助剂对照组和空白对照组熊蜂均表现正常，观察记录试验组熊蜂是否出现活动减少、行动缓慢，甚至出现精神萎靡不振、挂壁不动等症状，对比熊蜂对于几种待试药剂毒性症状的不同表现。

1.4 数据分析

利用IBM SPSS Statistics 20软件对试验所得数据进行Probit统计分析，计算得出毒力回归方程、LD50、95%置信区间，并分析每种农药对地熊蜂工蜂的毒性等级。

2 结果

2.1 不同农药对地熊蜂工蜂的急性经口毒性

试验中，加入待试药剂配制的糖水后，地熊蜂均取食干净，未出现拒绝采食或采食量很小的现象。由表1可知，通过饲喂法测得的各农药对地熊蜂工蜂的24 h的LD50值由小到大为：高效氯氟氰菊酯<异丙威<虫螨腈<氟吡呋喃酮<唑螨酯<除虫脲<联苯肼酯<啶酰菌胺<春雷霉素<螺虫乙酯<丁氟螨酯，LD50值分别为0.033,0.416,0.816,4.338,5.657,28.273,52.306,95.223,224.762,337.929和>500 μg a.i./蜂。其中，丁氟螨酯达到上限试验，即药剂剂量500 μg a.i./蜂时，24 h试验期未引起地熊蜂工蜂死亡，因此判定对地熊蜂的急性经口毒性24 h的半致死剂量LD50>500 μg a.i./蜂。除丁氟螨酯的各农药对地熊蜂工蜂的24 h的LD50均大于48 h的LD50。根据我国《化学农药环境安全评价试验准则.第10部分:蜜蜂急性毒性试验》中(袁善奎等,2014)，农药对蜜蜂急性毒性分级标准，11种农药的急性经口毒性除高效氯氟氰菊酯、异丙威和虫螨腈为高毒，氟吡呋喃酮和唑螨酯为中毒外，其余药物均为低毒。

2.2 不同农药对地熊蜂工蜂的急性接触毒性

由表2可知，通过接触法测得的各农药对地熊蜂工蜂的24 h的LD50值由小到大为：高效氯氟氰菊酯<异丙威<虫螨腈<除虫脲<氟吡呋喃酮<联苯肼酯<春雷霉素<唑螨酯<螺虫乙酯<丁氟螨酯<啶酰菌胺，LD50值分别为0.208,0.407,4.307,149.095,175.533,569.066,607.466,833.016,1 413.374,1 822.028和1 954.632 μg a.i./蜂。各农药对地熊蜂工蜂的24 h的LD50均大于48 h的LD50。根据我国《化学农药环境安全评价试验准则.第10部分:蜜蜂急性毒性试验》中(袁善奎等,2014)，农药对蜜蜂急性毒性分级标准，11种农药的急性接触毒性除高效氯氟氰菊酯和异丙威为高毒，虫螨腈为中毒外，其余药物均为低毒。

2.3 不同农药对地熊蜂工蜂的生态风险评估

不同农药对地熊蜂成年工蜂的生态风险评估结果见表3，通过饲喂法和接触法测得的48 h的LD50值计算得到11种农药对地熊蜂成年工蜂的危害熵值(HQ)。11种供试药物中，异丙威和高效氯氟氰菊酯的经口与接触危害熵值均位于50～2 500之间，为中风险；虫螨腈的经口危害熵值位于50～2 500之间，为中风险，但是接触危险熵值小于50，为低风险；氟吡呋喃酮、啶酰菌胺、除虫脲、唑螨酯、联苯肼酯、螺虫乙酯、春雷霉素、丁氟螨酯的经口与接触危害熵值均小于50，为低风险。通过风险熵值(RQsp)计算得出，除虫螨腈对熊蜂的经口风险、异丙威和高效氯氟氰菊酯对熊蜂的经口和接触风险为不可接受外，其余药物的风险均为可接受。

表3 11种农药对地熊蜂成年工蜂的危害熵值Table 3 Hazard quotient (HQ)values of eleven pesticides to adult workers of Bombus terrestris

农药类型Pesticidetypes药物类别Categories供试药物Testedpesticides试验类型TesttypeLD50(μga.i./individual)田间用量(ga.i./hm2)FieldrecommendeddoseHQ风险程度Riskassessment吡咯类虫螨腈经口Oral0.6784566.37中MediumPyrroleChlorfenapyr接触Contact2.91415.44低Low拟除虫菊酯类高效氯氟氰菊酯经口Oral0.03015500.00中MediumPyrethroidBeta-Cyhalothrin接触Contact0.18780.21中Medium新型烟碱类氟吡呋喃酮经口Oral3.50810229.08低Low杀虫剂NeonicotineFlupyradifurone接触Contact157.1080.65低LowInsecticides季酮酸类螺虫乙酯经口Oral266.814100.80.38低LowQuaternaryketoicacidSpirotetramat接触Contact1227.8640.08低Low氨基甲酸脂类异丙威经口Oral0.3166001898.73中MediumCarbamateIsoprocarb接触Contact0.3191880.88中Medium苯甲酰脲类除虫脲经口Oral23.0001506.52低LowBenzoylureaDiflubenzuron接触Contact138.4071.08低Low苯酰基乙腈类丁氟螨酯经口Oral>50080<0.16低LowBenzoylacetonitrileCyflumetofen接触Contact1691.2480.05低Low杀螨剂苯氧吡唑类唑螨酯经口Oral4.938306.08低LowAcaricidesPhenoxypyrazoleFenpyroximate接触Contact693.0690.04低Low联苯肼类联苯肼酯经口Oral42.425193.54.56低LowBiphenylhydrazineBifenazate接触Contact476.8390.41低Low抗生素类春雷霉素经口Oral149.12052.50.35低Low杀菌剂AntibioticKasugamycin接触Contact526.2570.10低LowFungicides吡啶酰胺类啶酰菌胺经口Oral87.3116006.87低LowPyridineamideBoscalid接触Contact1856.6536000.32低Low

2.4 地熊蜂工蜂对不同农药的毒性反应

地熊蜂工蜂对不同农药的反应表现为：高效氯氟氰菊酯和异丙威引起地熊蜂痉挛和抽搐颤动；氟吡呋喃酮则引起地熊蜂乱飞乱撞；除虫脲导致地熊蜂呆立不动；虫螨腈、唑螨酯和联苯肼酯引起地熊蜂移动迟缓，而后仰卧在地；螺虫乙酯和丁氟螨酯引起地熊蜂中毒表现为初期倒地翻滚，之后不能爬行移动；春雷霉素和啶酰菌胺作为杀菌剂，地熊蜂在取食或接触后，中毒症状为呆立不动。死亡的地熊蜂均表现为双翅张开、喙伸出、腹部收缩。

3 结论与讨论

近年来，农药对蜜蜂属包括西方蜜蜂Apismellifera和中华蜜蜂A.ceranacerana的毒性研究引起了业界广泛的关注，而作为全球范围内研究和商业化应用最为成熟的地熊蜂，对其关注不够，相关毒性研究比较少，并且还忽视了杀菌剂的毒性。本研究分别采用了饲喂法和接触法对地熊蜂成年工蜂进行了室内毒力测定，从测定结果来看，所选11种待试药物，无论采用饲喂法还是接触法，对地熊蜂成年工蜂的结果略有不同，其中高效氯氟氰菊酯和异丙威均为高毒；除虫脲、联苯肼酯、春雷霉素、螺虫乙酯、丁氟螨酯、啶酰菌胺均为低毒，而虫螨腈的经口毒性为高毒、接触毒性为中毒；氟吡呋喃酮和唑螨酯的经口毒性为中毒、接触毒性为低毒。11种农药对地熊蜂成年工蜂的24 h的LD50均大于48 h的LD50，这也说明随着药物作用时间的延长，药物对于地熊蜂的毒性也在增强。除异丙威的急性经口和急性接触的LD50值相差不大以外，其余药物急性经口毒性的LD50值要远远小于急性接触毒性，表明这些药物对于地熊蜂的胃毒能力要大于触杀能力。

在本研究中，虫螨腈作为吡咯类杀虫剂，是线粒体氧化磷酸化的解偶联剂，干扰质子浓度，干扰能量代谢，具有胃毒和一定的触杀作用，虫螨腈在地熊蜂上的急性经口毒性为高毒，与张艳峰等学者在意大利蜜蜂上测定的结果相一致，急性接触毒性为中毒，要弱于张艳峰等学者所得到的高毒结果(张艳峰和王会利,2020)。氟吡呋喃酮作为新烟碱类杀虫剂，是烟碱型乙酰胆碱受体的激动剂，使神经元细胞长时间处于激动状态，具有胃毒和触杀作用，氟吡呋喃酮在地熊蜂上的急性接触毒性为低毒，与王烁等学者研究的结果相一致，而急性经口毒性为中毒，要强于王烁等学者所得到的低毒结果(王烁等,2020c)。赵帅等学者研究发现，同样的有效成分不同的剂型作用在意大利蜜蜂上的急性毒性结果也存在很大差异(赵帅等,2011)。造成这2种药物急性毒性结果存在差异的原因可能是地熊蜂和蜜蜂的敏感性存在差异，也可能是与所选农药的剂型或助剂、溶剂不同有关。高效氯氟氰菊酯作为拟除虫菊酯类广谱杀虫剂，主要是破坏神经元钠离子通道，从而造成神经系统紊乱，具有触杀和胃毒作用，高效氯氟氰菊酯在地熊蜂上的急性毒性均为高毒，这与赵怡楠等学者在海南中蜂Apisceranahainana上(赵怡楠等,2014)，以及张艳峰等学者在意大利蜜蜂上测定的结果(张艳峰和王会利,2020)相一致。螺虫乙酯作为季酮酸类杀虫剂，主要是抑制乙酰辅酶A羧化酶活性，阻断昆虫能量代谢，是以胃毒作用为主、以触杀作用为辅，螺虫乙酯在地熊蜂上的急性毒性均为低毒，这与周浩等学者测定的结果(周浩等,2016)相一致。春雷霉素和啶酰菌胺作为杀菌剂，在地熊蜂上的急性毒性均为低毒，并且LD50值均较高，这与王雅珺等学者在中华蜜蜂上测定的结果(王雅君等,2017)相一致。由这些研究结果可以看出，对非靶标生物蜜蜂总科的不同属来说，同一有效成分，当它的理化性质和作用方式相同，所呈现的急性毒性结果也可能一致；而同一有效成分，当剂型或助剂、溶剂不同时，即使是对地熊蜂同种来说，农药的理化性质不同，进入虫体的途径及其穿透性也会存在差异，随之而来的急性毒性结果也略有不同。除虫脲作为苯甲酰脲类杀虫剂，主要是抑制昆虫几内质的合成，以胃毒作用为主、兼具触杀性，除虫脲在地熊蜂上的急性毒性结果均为低毒，与王烁等学者在地熊蜂上测定的氟铃脲、灭幼脲等其他苯甲酰脲类杀虫剂的结果(王烁等,2020a)相一致，但对比几种药物所测定得到的LD50值，仍存在着倍数差异，我们分析原因可能是：苯甲酰脲类杀虫剂的作用机理类似，对于地熊蜂也表现出相一致的毒性结果，但由于化学结构存在差异，苯胺环取代基不同，以及剂型或助剂、溶剂不同，理化性质也略有差异，因此LD50值差异较大。基于所有以上研究结果，我们综合分析后推断，药物所引起的急性毒性作用，与药物进入虫体的途径及其穿透性和作用机理有关，受药物的脂溶性、解离度、表面张力等理化性质，以及剂型或所用助剂、溶剂的影响。另外，在本研究中，异丙威作为氨基甲酸酯类杀虫剂，主要是吸附抑制乙酰胆碱酯酶，造成乙酰胆碱大量积聚，从而影响神经冲动传导，同样具有胃毒和触杀性，异丙威在地熊蜂上的急性毒性均为高毒。唑螨酯作为苯氧吡唑类杀螨剂，主要是作用于线粒体电子传递链复合体Ⅰ，从而抑制电子链传递影响能量合成；联苯肼酯作为联苯肼类杀螨剂，主要作用是抑制线粒体电子传递链复合体Ⅲ；丁氟螨酯是新型酰基乙腈类杀螨剂，主要作用是抑制线粒体电子传递链复合体Ⅱ，这3种药物作为农业上常用杀螨剂，均具有触杀和胃毒作用，除唑螨酯对地熊蜂成年工蜂的急性经口毒性为中毒、急性接触毒性为低毒外，其余2种药物的急性毒性结果均为低毒。

在设施作物花期使用地熊蜂授粉时，建议禁用异丙威、高效氯氟氰菊酯和虫螨腈这3种存在中风险的农药，慎重使用氟吡呋喃酮和唑螨酯这2种农药，以避免对地熊蜂造成危害，而另外6种低毒农药可根据田间情况合理施用，并可采取通风晾晒、设置放蜂间隔期等方式降低农药对地熊蜂的生态风险。