角膜上皮基底神经丛结构拼图法对全视网膜光凝后糖尿病患者角膜神经损伤的评估

黄淑兰 赵少贞 王效武 杨纪忠 郑晓汾 韩玉萍 赵炬伟 侯广平 于花

1天津医科大学眼科医院 天津医科大学眼视光学院 天津医科大学眼科研究所 国家眼耳鼻喉疾病临床医学中心天津市分中心 天津市视网膜功能与疾病重点实验室 300384；2山西省眼科医院，太原 030002

糖尿病是临床常见的慢性代谢性疾病，可引起全身多种组织器官的损害，在中国的患病率约为11.6%[1]。糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病严重的眼部并发症，其在糖尿病人群中的患病率高达23%[2]。全视网膜光凝术(panretinal photocoagulation，PRP)可有效阻止DR的进展[3]。但是，PRP在发挥治疗作用的同时也会对眼组织的正常结构和功能造成一定影响，如局部热量扩散导致Bruch膜破裂、脉络膜和神经纤维层损伤[4-5]。近年来，PRP对眼前节的影响也日益受到关注。研究表明,氩激光光凝会明显加重增生期DR患者的角膜神经损伤[6]。但也有研究发现PRP治疗后6个月和未接受PRP治疗的增生期DR患者角膜中央区角膜上皮基底神经丛(subbasal nerve plexus，SNP)密度并无明显差异[7]。角膜激光扫描共焦显微镜(corneal confocal laser scanning microscopy，CCM)是活体角膜神经检测的主要手段。CCM观察视野小且缺乏定位功能，不能保证对同一部位进行重复检查，由此获得的神经参数具有高度不确定性。因此需设立CCM检查的定位标志，以保证纵向研究中图像采集的一致性。SNP神经纤维呈放射状向中央聚集，最终在角膜顶点鼻下方1～2 mm处聚集形成一个旋涡状集合，称为涡状结构[8]。这一结构形态特殊，容易辨识，可能成为CCM检查的理想定位标志[9]。Edwards等[10]以涡状结构为起始和终止的标志设计了CCM图像采集流程，并利用计算机软件将检查得到的单张图像拼接合成大范围的SNP结构拼图，在此基础上再进行参数分析。这种方法不仅扩大了观察视野，使研究者获得更多的形态学信息，而且可针对同一区域进行重复测量，使神经参数分析具有更高的准确性和稳定性[11]，从而有效克服了CCM检查设备的局限性。本研究拟采用SNP结构拼图法观察PRP治疗前后SNP的变化并探讨其发病机制，为PRP治疗过程中角膜神经损伤的临床预防和治疗相关眼表病变提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采用随机对照研究方法，纳入2019年4—11月在山西省眼科医院就诊、经荧光素眼底血管造影确诊为2型糖尿病合并双眼DR Ⅳ期的患者57例114眼，其中男24例48眼，女33例66眼。采用随机数字表法将患者分为水平-垂直激光组和垂直-水平激光组。水平-垂直激光组29例58眼，其中男11例22眼，女18例36眼；平均年龄(55.01±4.49)岁；平均糖尿病病程(12.92±2.80)年。垂直-水平激光组28例56眼，其中男13例26眼，女15例30眼；平均年龄(54.94±4.15)岁；平均糖尿病病程(12.74±2.67)年。纳入标准：(1)双眼眼底病变符合DR Ⅳ期诊断标准[12]，即在非增生期DR，如微动脉瘤、视网膜硬性渗出、出血和棉绒斑的基础上出现视网膜新生血管或视盘新生血管；(2)年龄50～65岁；(3)经内分泌科确诊为2型糖尿病，且病程为10～15年；(4)糖化血红蛋白水平为6.5%～7.0%；(5)对数视力表单眼视力>0.1；(6)眼压正常；(7)眼表无明显炎症表现，角膜光滑、透明；(8)同意接受检查并能按时完成随访者。排除标准：(1)因瞳孔过小或玻璃体积血无法完成PRP者；(2)合并黄斑水肿或新生血管性青光眼者；(3)合并其他眼底血管性疾病或先天异常者；(4)有眼外伤、眼部手术及激光治疗史者；(5)有干眼、角膜斑翳、翼状胬肉、圆锥角膜、高度近视、变应性结膜炎、感染性角结膜炎、葡萄膜炎、青光眼或眼部持续用药史者；(6)有角膜接触镜佩戴史者；(7)有除糖尿病以外的其他影响神经功能的系统性疾病和相关治疗史者；(8)1型糖尿病或其他特殊类型的糖尿病患者；(9)糖尿病合并酮症酸中毒或高渗综合征患者；(10)有结缔组织病者；(11)有慢性肝脏或肾脏疾病者；(12)PRP或随访期间接受抗血管内皮生长因子药物或内眼手术治疗者：(13)随访期间需要补充激光治疗者。2个组患者各基线特征比较差异均无统计学意义(均P>0.05)(表1)。本研究遵循《赫尔辛基宣言》，经山西省眼科医院医学伦理委员会审核批准(批文号：201804b)，所有受检者对本研究目的和方法知情并自愿参加本研究，所有受检者均签署知情同意书。

表1 2个组受检者基线特征比较Table 1 Comparison of the baseline characteristics betweenthe two groups组别例数性别(男/女)a年龄(mean±SD,岁)b糖尿病病程(mean±SD,年)b水平-垂直激光组2911/1855.01±4.4912.92±2.80垂直-水平激光组2813/1554.94±4.1512.74±2.67t/χ2值0.6160.0580.281P值0.4330.9510.780 (a:χ2检验;b:独立样本t检验) (a:χ2 test;b:Independent samples t-test)

1.2 方法

1.2.1眼科检查 分别于PRP治疗前，治疗1周(第1次光凝后1周)、2周(第2次光凝后1周)、3周(第3次光凝后1周)、4周(第4次光凝后1周)和PRP完成后1个月行裂隙灯显微镜(SLM-8E，重庆康华瑞明科技股份有限公司)检查、裂隙灯显微镜下前置镜检查和非接触性眼压计(CT-80A，日本Topcon公司)测量，明确患者眼表是否有明显炎症，角膜是否存在斑翳、新生血管、增生物以及上皮是否完整，虹膜是否红变，前房是否存在炎症反应等，眼压是否正常以及眼底是否符合DR Ⅳ期表现，激光后是否有玻璃体积血等并发症。由同一位经验丰富医生采用频域光相干断层扫描仪(Spectralis OCT Blue Peak，德国海德堡工程有限公司)行荧光素眼底血管造影以评估双眼DR病情，视网膜无灌注区面积越大、新生血管数量越多或出现视盘新生血管，则说明病情越重。

1.2.2PRP治疗 根据荧光素眼底血管造影结果选择患者DR病情较重眼作为治疗眼，对侧眼作为对照眼。治疗眼治疗前采用复方托吡卡胺滴眼液[参天制药(中国)有限公司]点眼以充分扩瞳，采用盐酸丙美卡因滴眼液(美国爱尔康公司比利时分公司)点眼2次行表面麻醉。由同一位经验丰富的医生采用SupraScan 577多点扫描激光器(法国光太医疗公司)分4次完成标准PRP，每次间隔1周。水平-垂直激光组在行PRP治疗时先行水平子午线方向的视网膜光凝，光凝顺序为颞侧-鼻侧-下方-上方；垂直-水平激光组先行垂直子午线方向视网膜光凝，光凝顺序为下方-上方-颞侧-鼻侧。光凝采用方形矩阵模式，周边视网膜因弧度变化导致聚焦困难或邻近大血管处给予单点模式补充治疗。每次视网膜光凝光斑数为600～800个，疗程结束时，光斑总数达到2 500～3 000个。激光参数：光斑直径100～300 μm；功率100～200 mW；曝光时间0.05 s；光斑间隔1/2光斑直径；光凝强度达到Tso分级Ⅲ级轻～中度光斑反应。每次激光结束后均采用普拉洛芬滴眼液(山东海山药业有限公司)点眼，4次/d，持续1个月。

1.2.3疼痛程度评估 每次视网膜光凝后采用简式McGill疼痛问卷[13]对患者进行问卷调查并评分，内容包括疼痛分级指数、现时疼痛强度和视觉模拟评分。疼痛分级指数包含11个感觉项和4个情绪项，结果分为无、轻、中、重4项，分别计为0、1、2、3分；现时疼痛强度分为无痛、轻度不适、不适、难受、可怕的痛和极为痛苦6项，分别计为0、1、2、3、4、5分，评估时根据患者主观感受在相应分值上作记号；视觉模拟评分是使用1把长10 cm的标尺，0～10 cm相应地记为0～10分，0分表示无痛，10分代表难以忍受的剧烈疼痛或难受至想要摘除眼球的程度。评分时在标尺上用笔标出能代表自己发作时疼痛或难受程度的相应位置，医生根据患者标出的位置评估分数。总分为3种评分之和，评分越高表示疼痛越严重。每例患者共完成4次调查问卷，取平均值及重复率高者作为该患者的最终调查结果。

1.2.4CCM检查及局部神经形态图像的获取 采用海德堡Ⅱ代激光断层扫描系统(HRT-Ⅱ，德国海德堡工程有限公司)的Rostock角膜模块进行CCM检查。角膜接触帽与镜头之间的耦合剂为卡波姆滴眼液(美国博士伦公司)。检查前用盐酸丙美卡因滴眼液(美国爱尔康公司比利时分公司)点眼行表面麻醉。扫描深度定位到SNP层后，首先查找涡状结构，然后以该结构为中心以“回”字形方式向外移动物镜扩展检查范围，使用“section”模式快速采集涡状区及其周围2～3 mm范围的SNP图像。去除不聚焦或神经结构不全的图像，可以得到200～400张SNP图像。将图像在Photoshop CC 2017图像处理软件(美国奥多比系统公司)中载入堆栈，手动把具有重复区域的单张图像拼接合成局部神经形态图。拼接完成后由完成CCM检查的医生检查拼图的准确性，并纠正原始拼接处的图像错位或神经缺失。以涡状结构为中心裁剪700 μm×700 μm大小的图片，采用ImageJ软件的Neuron J插件进行神经参数定量分析，计算单位面积的神经纤维长度(nerve fiber length，NFL)。

1.2.5评估指标 主要评估指标为不同眼别及不同光凝顺序组间不同观察时间点SNP的NFL变化；次要评估指标为PRP后治疗眼的疼痛程度。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行统计分析。计量资料经Shapiro-Wilk检验证实呈正态分布，以mean±SD表示；计数资料以频数表示。水平-垂直激光组与垂直-水平激光组间患者年龄和糖尿病病程差异比较采用独立样本t检验，组间性别构成差异比较采用χ2检验；治疗眼和对照眼及不同激光组各时间点NFL总体差异比较均采用重复测量两因素方差分析，组内多重比较采用Tukey检验，同一时间点治疗眼和对照眼或不同组间NFL比较采用配对t检验。采用双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗眼和对照眼各观察时间点SNP比较

在PRP治疗眼中，接受PRP治疗后出现不同程度SNP神经结构缺失的神经损伤表现者11眼，以颞侧多见，其次为鼻侧；对照眼SNP神经纤维未观察到明显变化。不同观察时间点治疗眼与对照眼NFL总体比较差异均有统计学意义(F眼别=2.020，P=0.039；F时间=4.062，P=0.001)；治疗眼PRP治疗1、2、3、4周时NFL均明显低于治疗前，差异均有统计学意义(均P<0.05)，PRP治疗后1个月NFL低于PRP前，但差异无统计学意义(P>0.05)；对照眼各观察时间点NFL与治疗前比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。治疗眼与对照眼PRP治疗前NFL比较差异无统计学意义(P=0.991)；PRP治疗1、3、4周治疗眼NFL均低于对照眼，差异均有统计学意义(均P<0.05)；治疗眼PRP治疗2周和治疗后1个月NFL均低于对照眼，但差异均无统计学意义(均P>0.05)(表2)。

2.2 不同光凝顺序组间SNP损伤情况比较

水平-垂直激光组治疗眼第1次光凝(颞侧光凝)后出现颞侧SNP神经纤维部分或全部缺失者6例6眼，第2次光凝(鼻侧光凝)后出现鼻侧SNP神经纤维缺失者1例1眼；垂直-水平激光组治疗眼第3次光凝(颞侧光凝)后出现SNP颞侧神经纤维部分或全部缺失者3例3眼(图1)，第4次光凝(鼻侧光凝)后出现鼻侧SNP神经纤维缺失者1例1眼。2个组间治疗眼NFL值总体比较差异无统计学意义(F分组=0.099，P=0.754)，但治疗前后不同时间点NFL总体比较差异有统计学意义(F时间=5.231，P<0.001)。水平-垂直激光组PRP治疗1周、2周以及PRP治疗后1个月NFL均低于治疗前，差异均有统计学意义(均P<0.05)，垂直-水平激光组治疗前后不同时间点间NFL比较差异均无统计学意义(均P>0.05)；水平-垂直激光组与垂直-水平激光组PRP治疗前NFL比较差异无统计学意义(P=0.994)；PRP治疗1周、2周时水平-垂直激光组NFL均低于垂直-水平激光组，差异均有统计学意义(均P<0.05)；PRP治疗3周、4周以及治疗后1个月水平-垂直激光组与垂直-水平激光组NFL比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)(表3)。

图1 垂直-水平激光组治疗眼治疗前后不同时间点涡状区CCM图像(×800，观察视野1.0 mm×1.0 mm) 可见在第3次光凝后治疗眼出现颞侧神经纤维缺失 A：治疗前 B：治疗1周 C：治疗2周 D：治疗3周 E：治疗4周 F：治疗后1个月Figure 1 CCM images of the whorl-like region at various time points in the vertical-horizontal laser group (×800,view field:1.0 mm×1.0 mm) The loss of the temporal nerve fiber was found after the third photocoagulation A:Before treatment B:One week after the first PRP C:One week after the second PRP D:One week after the third PRP E:One week after the fourth PRP F:One month after PRP treatment

表3 不同光凝顺序组治疗眼不同时间点NFL比较(mean±SD,mm/mm2)Table 3 Comparison of NFL at various time points between the two groups(mean±SD,mm/mm2)组别眼数不同时间点NFL治疗前治疗1周治疗2周治疗3周治疗4周治疗后1个月垂直-水平激光组2815.00±3.7514.69±3.6514.89±3.6514.31±3.4314.34±3.6614.79±3.55水平-垂直激光组2915.53±3.2513.87±2.98ab14.02±3.26ab14.38±3.1814.32±3.0114.30±3.31a 注:F组别=0.099,P=0.754;F时间=5.231,P<0.001;F交互作用=2.894,P=0.015.与治疗前NFL比较,aP<0.05;与各时间点垂直-水平激光组NFL比较,bP<0.05(重复测量两因素方差分析,Tukey检验) NFL:神经纤维长度 Note:Fgroup=0.099,P=0.754;Ftime=5.231,P<0.001;Finteraction=2.894,P=0.015.Compared with respective pre-treatment NFL,aP<0.05;compared with NFL of the vertical-horizontal laser group at corresponding time points,bP<0.05 (Repeated measurement two-way ANOVA,Tukey test) NFL:nerve fiber length

2.3 PRP后治疗眼疼痛程度比较

简式McGill疼痛问卷调查显示，PRP后出现疼痛者9例9眼，总疼痛评分为6.78±2.73，其中7例7眼第1次光凝后出现疼痛。

3 讨论

DM患者的角膜被称为“高危角膜”，对外界侵袭的抵抗能力明显低于正常人[14]。Ozdemir等[15]研究认为，PRP是2型糖尿病患者眼表异常的高危因素。Neira-Zalentein等[16]研究发现，DR患者行PRP治疗后角膜知觉明显减退。角膜知觉是神经功能的重要体现，推测PRP可能会造成角膜神经损伤，但是由于活体角膜神经检测手段的局限性，目前国内外关于PRP对角膜神经的影响尚未达成共识[6-7]。本研究采用先进的拼图技术，借助SNP结构拼图良好的图像再现性和稳定性对角膜神经参数进行评估，发现PRP治疗后部分患者出现不同程度的神经损伤，且治疗后NFL均较治疗前下降，这一结果证实PRP可以导致DM患者角膜神经损伤。

目前PRP导致角膜神经损伤的确切机制尚未完全阐明，多数研究者推测可能与激光对睫状后长神经的热损伤有关。角膜的感觉神经起源于睫状后长神经，其在眼底位于水平子午线附近，形如面条状，呈黄白色或杏黄色，大多数在赤道稍后处即可分辨，前至锯齿缘。早在20世纪80年代即有视网膜光凝后患者出现调节功能障碍和瞳孔对光反应异常的报道[17-20]。龚颂建[21]也曾报道了2例患者接受半导体激光视网膜光凝后出现瞳孔散大、对光反射消失和角膜上皮糜烂，根据患者的临床表现多诊断为睫状神经损伤。但是，该研究只是根据临床体征进行的推断，并没有睫状神经损伤的直接证据，并且视网膜光凝采用的是氩离子或者半导体激光器，易产生热效应损伤。由于视网膜和脉络膜对氩激光具有较高的吸收率，因此氩离子激光器容易产生过多的光热效应；而半导体激光器输出的是810 nm的长波长激光，作用部位可深达脉络膜层[22]。因此，这2种激光的热效应比较容易透过脉络膜而刺激位于脉络膜上腔的睫状后长神经。随着激光技术的改进，目前临床上治疗DR常用577 nm的黄色激光，这种激光被认为是PRP治疗中的理想波长，国内外尚缺乏577 nm黄色激光对角膜神经影响的报道。本研究根据睫状后长神经在眼底的分布位置调整光凝顺序，分别观察了水平径线光凝和垂直径线光凝时SNP的改变，发现577 nm黄色激光在进行水平径线光凝时部分患者光凝侧SNP神经纤维部分或全部缺失，NFL明显下降；但在进行垂直方向光凝时并未发现明显的神经纤维缺失。这一结果间接说明577 nm黄色激光在进行水平径线光凝时也可以通过热传导损伤睫状后长神经，进而影响角膜SNP。

以往还有研究发现颞侧和鼻侧周边视网膜光凝时患者容易出现疼痛，认为与睫状后长神经的分布有关[23]。然而在本研究中，疼痛发生的时间以第1次光凝时多见，并未发现疼痛与视网膜的光凝部位有明显关系，考虑造成此差异的原因除了与患者情绪、心理素质以及治疗过程中的配合程度等因素有关外，还可能与激光波长和光凝模式的选择有关。

综上所述，本研究通过拼图技术证实了PRP可以导致DR患者角膜神经损伤，并且根据睫状后长神经在眼底的分布位置进一步调整光凝顺序，分别观察了水平径线光凝和垂直径线光凝时SNP的改变，验证了PRP通过热传导损伤睫状后长神经，进而影响角膜SNP的理论。本研究结果提示我们在进行水平子午线方向的视网膜光凝时应当注意避开睫状后长神经，在对其周围视网膜进行光凝时也应适当调整激光能量，尽量避免损伤睫状后长神经。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明黄淑兰：参与选题、设计及资料的分析和解释，起草文章，根据编辑部的修改意见进行论文修改；赵少贞：指导选题、设计，对文章的知识性内容作批评性审阅；王效武、杨纪忠、郑晓汾、韩玉萍：技术或材料支持，资料的分析和解释；赵炬伟、侯广平：实施研究；于花：实施研究，收集数据，参与选题、设计及资料的分析和解释，修改论文中关键性结果和结论，根据编辑部的修改意见进行论文修改