人脐带间充质干细胞源性小细胞外囊泡静脉注射对小鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎的治疗作用

栗勇涛 段雅楠 李焕 张智慧 任新军 李筱荣 张晓敏

天津医科大学眼科医院 天津医科大学眼视光学院 天津医科大学眼科研究所 300020

自身免疫性葡萄膜炎是一种严重威胁视力的疾病，治疗棘手且易复发,传统药物治疗方法主要包括糖皮质激素及免疫抑制剂，但较多的毒性及不良反应限制了其在临床上的应用。研发安全、有效的新型治疗药物一直是葡萄膜炎领域的研究热点[1]。间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSCs)是来源于中胚层的成体干细胞，具有较强的免疫调节作用，可以抑制自身免疫、移植免疫、抗肿瘤免疫等多种类型的免疫应答[2-4]。已有许多研究者将MSCs应用于实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis，EAU)模型的治疗，并证明了其有效性[5-7]。然而，随着研究的不断深入，MSCs治疗也暴露出种种局限性和风险，如何寻找可替代MSCs的新疗法是目前研究的重点。研究表明，MSCs主要通过旁分泌和细胞间直接接触途径发挥免疫调节功能，其中旁分泌途径被认为在免疫调节功能中发挥更重要的作用[8-9]。外泌体是一种可由几乎所有细胞分泌、直径在40～150 nm、具有双层脂质膜结构、源于晚期核内体的膜性微囊泡。由于常用的外泌体分离方法无法完全去除非外泌体成分，且无法证明分离所得外泌体均来源于母细胞核内体，因此目前国际专家组更推荐使用小细胞外囊泡(small extracellular vesicles，sEVs)这一名词进行命名[10]。有研究表明，MSCs源性sEVs拥有与MSCs相似的功能，有望作为一种新型的无细胞生物制剂替代干细胞疗法[11]。本研究拟探讨尾静脉注射MSCs源性sEVs对EAU模型小鼠的疗效及其作用机制，为进一步的临床转化提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 SPF级7周龄无眼部及全身病变的C57BL/6雌性小鼠51只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验动物培养于天津医科大学眼科研究所动物房，饲养固定室温为(23±2)℃，固定湿度为(55±10)%，光照昼夜节律各12 h。本实验中所有操作程序均遵循天津医科大学动物保护与伦理委员会相关规定。本研究方案经天津医科大学眼科医院伦理委员会审批(批文号：TJYY2019103022)。

1.1.2主要试剂及仪器 DMEM-F12培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、胶原蛋白酶Ⅱ(美国Gibco公司)；流式抗体CD4、流式抗体白细胞介素(interleukin，IL)-17A、流式抗体干扰素(interferon，IFN)-γ、流式固定液/透膜液(美国eBioscience公司)；佛波醇(phorbol myristate acetate，PMA)、布雷菲德菌素A (brefeldin A，BFA)(美国Sigma公司)；重组小鼠IL-12 (419-ML)、IL-2 (402-ML)、转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1 (7666-MB)、IL-6 (406-ML)、抗小鼠IFN-γ抗体(MAB485)、抗小鼠IL-4抗体(MAB404)(美国R&D公司)；磁珠阴选小鼠初始CD4+细胞试剂盒(美国Invitrogen公司)；X-VIVO 15无血清培养基(瑞士LONZA公司)；BCA蛋白定量试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；光感受器间维生素A类结合蛋白651-670 (interphotoreceptor retinoid binding protein 651-670，IRBP651-670)(上海生物工程公司)；小鼠抗人CD9 (ab2215)、CD63 (ab193349)、CD81 (ab79559)、β-actin单克隆抗体(ab6267)、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记山羊抗小鼠IgG二抗(ab205719)、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine，BrdU)细胞增生试剂盒(美国Abcam公司)。Csγ137照射仪(加拿大Avestin公司)；超速离心机(美国Beckman公司)；透射电子显微镜(荷兰Phillips公司)；Nanosight颗粒粒度分析仪(英国NanoSight公司)；流式细胞仪(美国Beckman公司)。

1.2 方法

1.2.1MSCs源性sEVs的分离 MSCs由贝来生物科技有限公司(北京)提供。MSCs分离步骤：取无妊娠期并发症健康产妇的脐带，置于培养皿中，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)洗去血水后将脐带剪至2～3 cm段状，含300 U/ml(商品单位)青/链霉素浸泡10 min，剥离脐带血管，将剩余华通胶组织剪成1～2 mm3组织碎块，用质量分数0.1%胶原酶Ⅱ于37 ℃条件下消化1 h，取上清液备用，剩余残留组织用质量分数0.125%胰蛋白酶于37 ℃条件下消化30 min，过100目细胞筛网，收集上清液。采用PBS将所得的消化上清液稀释1倍后300×g离心5 min，弃上清，完全培养基(含体积分数10% FBS+100 U/ml青/链霉素+2 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM-DF12培养基)重悬细胞。细胞以1×106/cm2密度接种于细胞培养瓶中，置入体积分数5% CO2的37 ℃细胞培养箱中培养，培养3 d后首次换液，之后隔日换液1次，直至细胞达到80%融合后传代。取3～5代MSCs用于后续实验。

传代后的MSCs用完全培养基培养24 h后，更换为含10%无sEVs FBS (110 000×g过夜离心后，0.22 μm滤器过滤)的完全培养基继续培养24 h，收集细胞培养上清液；取细胞上清液于4 ℃下200×g离心10 min，2 000×g离心20 min，10 000×g离心30 min，110 000×g离心70 min，弃上清，PBS重悬沉淀，110 000×g离心70 min，PBS重悬沉淀，0.22 μm滤器过滤后备用。采用BCA试剂盒对sEVs蛋白进行定量。

1.2.2MSCs源性sEVs的鉴定 (1)透射电子显微镜鉴定sEVs形态 将sEVs样品稀释至0.01 μg/ml，质量分数4%多聚甲醛固定5 min；取20 μl样本滴于铜网状栅上，静置5 min，滴加2%醋酸双氧乙铀溶液负染固定3 min，去除多余液体后，烘干并于透射电子显微镜下观察并拍照。(2)Nanosight分析sEVs粒径 将sEVs用双蒸水稀释至0.001 μg/ml，设置Nanosight颗粒粒度分析仪循环次数和时间，取1 ml样本上样，检测sEVs粒径大小；采用Nanosight NTA3.3软件分析数据。(3)Western blot法检测sEVs表面标志物CD9、CD81、CD63表达 取20 μg sEVs总蛋白样品充分裂解，95 ℃变性5 min后上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白质恒压(85 V，2 h)转印至PVDF膜上；取膜用含质量分数5%脱脂牛奶的TBST溶液室温封闭1 h，置于CD9 (1∶ 1 000稀释)、CD63 (1∶ 1 000稀释)、CD81 (1∶ 1 000稀释)一抗4 ℃条件下孵育过夜；TBST充分洗膜后，置于相应二抗室温条件下孵育1 h，TBST洗膜后进行ECL显色，分析各条带灰度值，以MSCs裂解蛋白作为对照。

1.2.3EAU模型的制备及分组处理 将250 μg IRBP651-670多肽片段溶于终体积100 μl PBS中，再与等体积含3.5 mg/ml结核菌素的完全弗氏佐剂充分混合直至混合液呈乳状，且滴水未见明显扩散。按照0.1 ml/10 g腹腔内注射体积分数4%水合氯醛麻醉小鼠，将上述乳液均匀注射于单只小鼠双侧腹股沟及近尾部背部；分别于造模前30 min及造模后24 h每只小鼠腹腔内注射100 μl含有0.5 μg百日咳毒素的PBS。将48只EAU造模小鼠编号后按照随机数字表法分为PBS对照组和sEVs治疗组，每组24只小鼠。在造模后11 d，sEVs治疗组小鼠接受尾静脉注射MSCs源性sEVs 50 μg，PBS对照组尾静脉注射相同体积PBS。

1.2.4EAU小鼠眼底炎症评分及病理评分观察 各组分别随机选取6只小鼠，自造模后8 d起，隔日经复方托吡卡胺滴眼液扩瞳后用90 D前置镜辅助双目间接检眼镜观察各组小鼠眼底炎症情况，并进行炎症评分。于造模后18 d，各组分别随机选取6只小鼠，颈椎脱臼法处死，立即摘取小鼠双眼眼球并置于含体积分数4%戊二醛和体积分数10%甲醛的固定液中固定，常规脱水，石蜡包埋，沿矢状面行5 μm切片；取石蜡切片行苏木精-伊红染色，梯度乙醇脱水后封片，置于倒置显微镜下观察，参照Caspi分级[12]对小鼠眼底病理炎症进行评分。

1.2.5流式细胞术检测小鼠眼球组织中CD4+IL-17A+细胞及CD4+IFN-γ+细胞比例 于造模后18 d，各组分别随机选取6只小鼠，颈椎脱臼法处死，摘取小鼠双眼眼球，剪去外露视神经、角膜及残留结缔组织，挤出晶状体，充分剪碎其余组织，采用胶原蛋白酶D消化30 min，过200目滤网后350×g离心5 min，加入0.2 ml PBS制作细胞悬液；加入终质量浓度50 ng/ml PMA、1 μg/ml 离子霉素和1 μg/ml BFA刺激5 h，350×g离心5 min后重悬细胞，加入CD4-APC抗体染色20 min，加入固定液固定20 min，破膜液破膜30 min，行胞内IL-17A-PE/IFN-γ-FITC染色，避光孵育30 min；350×g离心5 min后弃上清，加入500 μl PBS重悬细胞，采用流式细胞仪检测CD4+IL-17A+细胞及CD4+IFN-γ+细胞比例，评估眼球中Th1细胞、Th17细胞浸润情况。

1.2.6BrdU法检测小鼠脾脏及引流淋巴结中T细胞增生能力 于造模后14 d，各组分别颈椎脱臼法处死6只小鼠，立即取出脾脏及引流淋巴结，制作淋巴细胞悬液；尼龙柱法分离T细胞及APC细胞，并对APC细胞进行γ射线照射(剂量37 Gy) 40 min；将T细胞与APC细胞以2∶ 1比例混合接种至96孔板中，分别加入终质量浓度0、1、10和20 μg/ml IRBP651-670共孵育48 h，按照BrdU试剂盒说明书检测T细胞增生情况，采用酶标仪检测450 nm处吸光度(A450)值。

1.2.7流式细胞术检测小鼠初始T细胞体外向Th1细胞、Th17细胞分化情况 取3只正常小鼠，颈椎脱臼法处死后取脾脏组织，充分研磨后，过200目滤网后350×g离心5 min后弃上清，采用红细胞裂解液重悬细胞，冰上静置5 min后350×g离心5 min，PBS重悬，细胞计数；参照初始CD4+T细胞阴选试剂盒说明书分选初始CD4+T细胞；按照2×105/孔的细胞密度，将初始CD4+T细胞接种于预孵育CD3抗体的96孔板中，分为PBS对照组和sEVs处理组，分别加入终质量浓度10 μg/ml sEVs或等体积PBS共孵育；将细胞置于含2 μg/ml CD28抗体、10 ng/ml IL-12、10 mg/ml IL-4抗体的X-VIVO 15无血清培养基中培养5 d后采用流式细胞仪检测分化为Th1细胞的情况；将细胞置于含30 ng/ml IL-6、2.5 ng/ml TGF-β1、10 mg/ml IL-4抗体和10 mg/ml IFN-γ抗体X-VIVO 15无血清培养基中培养5 d后采用流式细胞仪检测分化为Th17细胞的情况。

1.3统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行统计分析。计量资料经Shapiro-Wilk法检验均呈正态分布，以mean±SD表示。sEVs治疗组与PBS对照组各测量指标差异比较采用独立样本t检验。采用双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人脐带MSCs源性sEVs的鉴定

倒置显微镜下，分离的MSCs呈成纤维细胞样、漩涡样排列。Nanosight粒径结果显示sEVs平均直径为(102.4±33.6)nm，D50为95.5 nm，D90为147.3 nm(图1A)。透射电子显微镜下可观察到sEVs呈大小相对均一的圆形杯口状双层膜囊泡结构(图1B)。Western blot结果显示sEVs中CD9、CD63、CD81蛋白高表达(图1C)。

2.2 MSCs源性sEVs对EAU小鼠的治疗效果

造模后14、16、18、20和22 d，sEVs治疗组眼底炎症评分均较PBS对照组降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)(图2)。造模后18 d，PBS对照组和sEVs治疗组眼球组织中CD4+IFN-γ+Th1细胞百分比分别为(21.35±0.72)%和(15.55±2.03)%，CD4+IL-17A+Th17细胞百分比分别为(20.90±1.10)%和(15.67±2.15)%，sEVs治疗组中Th1细胞百分比和Th17细胞百分比均明显低于PBS对照组，差异均有统计学意义(t=6.58、5.31，均P<0.01)(图3)。造模后18 d，sEVs治疗组眼球石蜡切片病理评分为1.59±0.38，明显低于PBS对照组的2.08±0.38，差异有统计学意义(t=2.30，P<0.05)(图4)。

图1 MSCs源性sEVs的鉴定 A：sEVs的Nanosight粒径分析 B：sEVs的透射电子显微镜图像(标尺=200 nm，×500 000) 可见sEVs呈圆形杯口状双层膜囊泡结构 C：sEVs表面标志物表达电泳图 sEVs中CD81、CD63和CD9均呈高表达 MSCs：间充质干细胞；sEVs：小细胞外囊泡Figure 1 Identification of sEVs A:Particle size measured with Nanosight B:Transmission electron microscope image (bar=200 nm,×500 000) sEVs presented the rim of a round cap with double-membrane vesicles C:Electrophoretogram of surface markers of sEVs CD9,CD63 and CD81 were highly expressed in sEVs MSCs:mesenchymal stem cells;sEVs:small extracellular vesicles

图3 PBS对照组和sEVs治疗组眼球组织中Th1和Th17细胞浸润情况 A:各组眼球组织中Th1和Th17细胞流式细胞图 B～C:sEVs治疗组与PBS对照组眼球组织中Th1和Th17细胞百分比比较 与PBS对照组比较，aP<0.01 (独立样本t检验，n=6) PBS：磷酸盐缓冲液；sEVs：小细胞外囊泡；IL：白细胞介素；IFN：干扰素Figure 3 Infiltration of Th1 and Th17 cells in eyeballs of different groups A:Th1 and Th17 cells infiltration in the PBS control group and sEVs treatment group determined by flow cytometry B-C:Comparison of the proportion of Th1 and Th17 cells between the two groups Compared with the PBS group,aP<0.01 (Independent samples t-test,n=6) PBS:phosphate buffer solution;sEVs:small extracellular vesicles;IL:interleukin;IFN:interferon

图2 PBS对照组及sEVs治疗组眼底炎症评分时间曲线 各组小鼠眼底炎症评分于造模后10～12 d开始明显升高，并于造模后16 d趋于稳定 与sEVs治疗组相比，aP<0.05(独立样本t检验，n=6) PBS：磷酸盐缓冲液；sEVs：小细胞外囊泡Figure 2 Fundus clinical score-time curves of different groups The fundus clinical scores of the PBS control group and sEVs treatment group were significantly elevated from day 10 or 12 and stable from day 16 following modeling Compared with the sEVs treatment group,aP<0.05 (Independent samples t-test,n=6) PBS:phosphate buffer solution;sEVs:small extracellular vesicles

2.3 各组小鼠脾脏及引流淋巴结中T细胞增生情况比较

1、10、20 μg/ml IRBP651-670刺激条件下sEVs治疗组脾脏及引流淋巴结中T细胞增生A450值低于PBS对照组，其中，仅20 μg/ml IRBP651-670刺激条件下2个组间A450值比较，差异有统计学意义(t=3.44，P<0.05)(表1)。

2.4 小鼠脾脏初始T细胞体外向Th1、Th17细胞分化结果情况比较

sEVs处理组脾脏初始T细胞分化为IFN-γ+细胞(Th1细胞)和IL-17A+(Th17细胞)的百分比分别为(28.15±1.32)%和(11.60±2.23)%，明显低于PBS对照组的(31.58±1.75)%和(23.52±1.76)%，差异均有统计学意义(t=3.93、10.26，均P<0.05)(图5)。

图4 PBS对照组和sEVs治疗组眼球组织炎症情况比较 A：PBS对照组眼球组织病理染色(HE ×100，标尺=100 nm) 视网膜组织结构紊乱，有炎性细胞浸润 B：sEVs治疗组眼球组织病理染色(HE ×100，标尺=100 nm) 与PBS对照组比较，sEVs治疗组小鼠视网膜组织结构紊乱程度减轻，视网膜组织炎性细胞浸润减少 C：各组眼球组织病理炎症评分比较 与PBS对照组比较，aP<0.05 (独立样本t检验，n=6) PBS：磷酸盐缓冲液；sEVs：小细胞外囊泡Figure 4 Pathological scores of eyeballs in different groups A:Pathological staining of eyeballs in the PBS control group (HE ×100,bar=100 nm) Retinal structure disorder and inflammatory cell infiltration were found B:Pathological staining of eyeballs in the sEVs treatment group (HE ×100,bar=100 nm) The disorder of retinal structure and the cells infiltration were reduced in the sEVs treatment group compared with the PBS control group C:Comparison of pathological scores of eyeballs between the two groups Compared with the PBS control group,aP<0.05 (Independent samples t-test,n=6) PBS:phosphate buffer solution;sEVs:small extracellular vesicles

表1 各质量浓度IRBP651-670条件下PBS对照组与sEVs治疗组间小鼠脾脏及引流淋巴结中T细胞增生A450值比较(mean±SD)Table 1 Comparison of A450 values of T cells inspleen and draining lymph nodes between different groups(mean±SD)组别样本量不同质量浓度IRBP651-670下增生A450值0 μg/ml1 μg/ml10 μg/ml20 μg/mlPBS对照组61.24±0.991.46±0.131.81±0.122.13±0.06sEVs治疗组61.22±0.781.41±0.081.73±0.152.00±0.08t值0.300.871.063.44P值0.770.400.310.007 注:(独立样本t检验) IRBP:光感受器间维生素A类结合蛋白;PBS:磷酸盐缓冲液;sEVs:小细胞外囊泡 Note: (Independent samples t-test) IRBP:interphotoreceptor retinoid binding protein;PBS:phosphate buffer solution;sEVs:small extracellular vesicles

图5 PBS对照组和sEVs处理组小鼠脾脏初始T细胞向Th1细胞、Th17细胞体外分化情况 A：各组小鼠脾脏初始T细胞向Th1细胞分化流式细胞图 B：各组小鼠脾脏初始T细胞向Th17细胞分化流式细胞图 C～D：各组小鼠脾脏初始T细胞中分化为Th1细胞和Th17细胞的百分比比较 与PBS对照组比较，aP<0.05(独立样本t检验，n=6) PBS：磷酸盐缓冲液；sEVs：小细胞外囊泡；IFN：干扰素；IL：白细胞介素Figure 5 Differentiation of naive T cells into Th1/Th17 cells in vitro in different groups A:Flow cytometry results of differentiation of naive T cells into Th1 cell in the two groups B:Flow cytometry results of differentiation of naive T cells into Th17 cell in the two groups C-D:Comparison of the proportion of differentiation of naive T cells into Th1/Th17 cell between the two groups Compared with the PBS group,aP<0.05 (Independent samples t-test,n=6) PBS:phosphate buffer solution;sEVs:small extracellular vesicles;IFN:interferon;IL:interleukin

3 讨论

MSCs疗法已经广泛应用于多发性硬化、系统性红斑狼疮、桥本甲状腺炎、克罗恩病以及葡萄膜炎等多种自身免疫性疾病的治疗研究，并取得了积极的成果，展现出良好的前景[13-16]。本课题组前期的研究也发现在过继转移EAU大鼠模型中，静脉注射MSCs可以缓解EAU造成的炎症损伤，其短期治疗效果与地塞米松治疗组相似，长期疗法优于地塞米松治疗组[7]。Oh等[5]研究发现，腹腔内注射MSCs可以减轻小鼠EAU炎症反应，并认为MSCs可以抑制Th1细胞及Th17细胞的产生，促进B220+CD19+细胞的产生。Tasso等[6]研究也发现在造模同时腹腔内注射MSCs可以减轻小鼠EAU炎症反应，并且MSCs可以通过旁分泌TGF-β诱导CD4+T细胞向抗原特异性调节性T细胞分化。

然而，随着各项关于MSCs活体研究的不断深入，MSCs疗法也暴露出一些局限性及安全隐患。有研究表明，静脉注射的MSCs在活体内存活时间十分有限，只有不到1%的MSCs可以存活超过1周[17]。另外还有动物实验表明，活体注射MSCs存在瘤变及心肌梗塞的风险[18-19]。

sEVs存在于血液、唾液、泪液、尿液等多种体液中，也广泛存在于细胞培养上清液中。sEVs中包含丰富的mRNA、小干扰RNA、脂类和蛋白质，并可将这些物质传递给靶细胞，引起下游生物反应[20]。与MSCs相比，sEVs不会复制、分化或发生突变，致瘤风险大大降低。得益于其纳米级直径，sEVs阻塞血管的风险也大大降低。此外，sEVs更加稳定、容易储存和运输，且不会引起免疫排斥反应。有研究发现-20 ℃条件下储存5年的sEVs中RNA质量与新鲜分离的sEVs相比无明显下降[21]。MSCs源性sEVs已证实在多种疾病实验模型中发挥治疗作用，如外伤性脑损伤、脑卒中、阿尔茨海默病等[22]。关于MSCs源性sEVs的临床试验也在全世界展开，目前临床试验注册网上登记的关于MSCs源性sEVs (或外泌体)的临床试验已有10项。本研究将MSCs源性sEVs用于EAU小鼠模型的治疗，结果显示尾静脉注射sEVs可以缓解EAU疾病的发展，抑制脾脏及引流淋巴结中T细胞的增生能力，同时减少眼部Th1细胞、Th17细胞浸润。

早期研究结果认为Th1/Th2平衡紊乱主导了EAU的病理过程。Th1细胞为EAU炎症反应中主要的致病性效应T细胞，可分泌IFN-γ、IL-12等炎性因子；而Th2细胞可以分泌IL-10、IL-4和IL-13等多种抑炎因子，从而发挥免疫抑制功能。然而，随着研究的深入，研究者们发现Th17细胞和Treg细胞在EAU炎症进程中发挥了不可取代的作用[23]。目前认为Th1细胞和Th17细胞共同介导了EAU模型中的炎症损伤。本研究结果表明，10 μg/ml的MSCs源性sEVs可以抑制初始T细胞体外向Th1细胞、Th17细胞分化，其中抑制Th17细胞分化的能力较强，推测MSCs源性sEVs对Th1、Th17细胞分化的抑制作用是其发挥治疗作用的机制之一。未来我们将对MSCs源性sEVs抑制Th1细胞、Th17细胞的作用机制进行更深入的研究。

综上所述，本研究结果表明尾静脉注射MSCs源性sEVs可以有效缓解EAU小鼠模型的疾病进展，并减少眼球中Th1细胞、Th17细胞浸润。本研究还表明，MSCs源性sEVs在抑制脾脏及引流淋巴结中T细胞增生的同时，还可以抑制初始T细胞体外向Th1细胞、Th17细胞分化。与MSCs相比，MSCs源性sEVs治疗的安全性更高，更易实现商业化大规模生产和运输。随着基础和临床研究的进一步开展，MSCs源性sEVs未来有望成为新型自身免疫性疾病治疗药物。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突