罗非鱼无乳链球菌毒力检测及药敏试验

叶梓茵 ， 欧慧慧 ， 丁月霞

(广东海洋大学滨海农业学院动物医学系 ， 广东 湛江 524088)

早在1957年，鱼类链球菌病在日本被发现，随后世界各地陆续出现鱼类感染链球菌的情况[1]。我国的罗非鱼养殖主要集中在南方地区，引起我国南方罗非鱼链球菌病的致病菌主要是无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)，罗非鱼对链球菌高度敏感，全年可发病[2]。据统计,近几年我国南方大部分罗非鱼养殖鱼塘，由链球菌病引起罗非鱼死亡的死亡率普遍在30%～50%[3]。同时，无乳链球菌也是人、牛和鱼等多种生物的重要致病菌之一[4]，因此，罗非鱼感染无乳链球菌除了会给罗非鱼养殖产业带来严重的经济损失外，还有引起食用者一同感染无乳链球菌的风险。罗非鱼感染无乳链球菌后鱼类肠道优势菌群结构会被改变,导致肠道内潜在致病菌数量增加[5]，进而增加了罗非鱼无乳链球菌与其他鱼类致病菌混合感染的风险。本试验主要通过检测从广东省肇庆市某罗非鱼养殖场中分离出的罗非鱼无乳链球菌(ZQ0910)的致病力强弱、部分抗菌药对其的作用效果以及所携带的致病基因3个 方面，为该罗非鱼养殖场提供有参考价值的防治措施。

1 材料与方法

1.1 试验菌株 试验所用菌株为尼罗罗非鱼无乳链球菌野生菌株(ZQ0910)，分离自广东省肇庆市某罗非鱼养殖场，由广东海洋大学水产学院提供。

1.2 实验动物 清洁级昆明小鼠，体重18～22 g， 雌雄各半，购自广东医科大学实验动物中心，许可证号SYXK(粤)2015—0104。

1.3 主要药品与试剂 试验所用12种抗菌药由广东海洋大学教学动物医院提供；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；脑心浸液肉汤培养基(BHI)，购自英国OXOID公司；LB营养肉汤培养基，购自广东环凯生物有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；rTaq酶，购自TaKaRa公司。

1.4 菌株半数致死量(LD50)测定 将小鼠适应性饲养1周，无异常情况开始试验。将30只小鼠随机分为5个试验组和1个空白对照组。用0.5麦氏比浊管将菌液浓度校正至1×108CFU/mL，稀释成5个 适合的浓度，试验组小鼠进行0.5 mL/只腹腔注射，对照组腹腔注射等量无菌肉汤。攻毒后观察14 d。测定LD0和LD100的菌液浓度。将试验小鼠数量扩大到10只∕组，验证LD0和LD100值。

将30只小鼠随机分为5个试验组和1个空白对照组。根据LD0和LD100的浓度，设计5个不同剂量浓度。试验组分别每只腹腔注射0.5 mL不同浓度的菌液，空白对照组腹腔注射等量无菌肉汤，试验组剂量设计见表1。攻毒后连续观察14 d，记录中毒小鼠的中毒表现、死亡时间。及时无菌剖检死亡小鼠，观察死亡小鼠的病理变化，从肝、脾、肾、心、脑采样，样本用革兰染液染色进行镜检。记录并整理数据，采用Bliss法[5]计算菌株的LD50。

表1 无乳链球菌LD50Table 1 LD50 of Streptococcus agalactiae

1.5 毒力基因检测

1.5.1 引物合成 5种毒力基因包括cfb、cpsE、sip、hylB和ponA，引物序列、退火温度及片段大小见表2。

表2 PCR扩增引物Table 2 Primers for PCR amplification

1.5.2 PCR扩增 采用细菌DNA试剂盒提取法提取菌株的DNA，反应体系：DNA模板0.5 μL，上下游引物各0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，Taq酶0.125 μL，ddH2O 18.875 μL；反应体系运行参数：预变性94 ℃ 5 min；变性 94 ℃30 s、退火30 s、延伸72 ℃ 1 min，30个循环；终延伸72 ℃10 min。产物4 ℃保存。

PCR扩增产物经1% 琼脂糖凝胶电泳检测，电压115 V，电泳25 min后于凝胶成像系统中观察PCR产物条带。

1.6 最小抑菌浓度(MIC)的测定 采用微量肉汤2倍稀释法。工作菌液浓度调整为105CFU/ mL，抗菌药工作浓度为1 280 μg/mL。在96孔板A1孔中加入180 μL工作菌液，A2～A10分别加入100 μL。在A1孔加入20 μL相应抗菌药。充分吹打、混合后，均匀地吸入100 μL并添加到第2孔。以此类推依次稀释到第11孔，弃去100 μL。第12孔为无菌肉汤空白对照。各孔药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL和0 μg/mL。将96孔细胞培养板放在37 ℃生化培养箱中培养16～24 h后观察结果，每种药物3次平行试验。结果判断：对肉眼可见孔内肉汤明显混浊的判为阳性，以肉汤清亮无菌生长最低浓度的一孔的浓度为最小抑菌浓度。

1.7 体外联合药敏试验 采用微量肉汤稀释棋盘法。以单药MIC作为中心浓度，将每种抗菌药的浓度稀释到32MIC。在试管中设计7个菌药浓度，分别为16 MIC、8 MIC、4 MIC、2 MIC、1 MIC、1/2 MIC和1/4 MIC。横向加入甲药：在96孔板A1～A8孔中依次加入甲药的第1个浓度(16 MIC)，每孔各100 μL。96孔板的第B～G排依次加入甲药剩余6个浓度。纵向加入乙药：在96孔板1A～1H孔加入乙药的第1个浓度，96孔板的第2～7列依次加入乙药的剩余6个浓度。第8列为A药的单药对照，H排为B药的单药对照。试验中设计空白对照及阳性对照。

结果判断：试验中以部分抑菌浓度(FIC指数)的计算结果作为联合药敏试验的判断依据。FIC指数=甲药联合时的MIC /甲药单用时的MIC+乙药联合时的MIC/ 乙药单用时的MIC。FIC≤0.5为协同作用；0.52为拮抗作用。

2 结果

2.1 菌株LD50测定 试验组小鼠在攻毒24 h内集中发病并出现死亡，结果见表1。试验测定无乳链球菌ZQ0910的LD0为15 CFU/mL，LD100为1.5×104CFU/mL，采用Bliss法算出无乳链球菌ZQ0910的LD50为402.35 CFU/mL。

试验组小鼠表现为精神沉郁、闭目缩颈、食欲下降、全身抖动、蜷缩于角落、被毛凌乱、体形消瘦，病情加重后，发病小鼠呈抽搐状，嘴鼻发绀。无菌剖检小鼠，发现胸腔和腹腔有积液，肺脏和心脏有出血点，胸腔内器官多表现为败血症状。死亡小鼠的肝、脾、肾、心、脑组织革兰染色后镜检，均检测到链状排列的革兰阳性球菌。对照组小鼠精神正常，食欲良好，未发生死亡。

2.2 毒力基因检测 结果如图1所示。通过PCR检测该无乳链球菌病可能存在的5个致病基因，结果显示:sip、cpsE及空白对照组均为阴性，没有扩增出任何条带;hylB、ponA和cfb分别扩增出346、525 bp 和763 bp的特异性条带，结果呈阳性，扩增出的片段均与预期的目的片段大小相同。因此，所测的5个致病基因中无乳链球菌ZQ0910含有hylB、ponA和cfb，不含sip和cpsE。

图1 PCR扩增结果Fig.1 Results of PCR amplificationM： 5 000 bp marker； N：空白对照； 1、2： cfb； 3、4： sip； 5、6： ponA； 7、8： cpsE； 9、10: hylBM： 5 000 bp marker； N：Blank control； 1,2： cfb； 3,4： sip； 5,6： ponA； 7,8： cpsE； 9,10: hylB

2.3 单药MIC测定 罗非鱼无乳链球菌对抗菌药MIC的测定结果如表3所示，阿莫西林对无乳链球菌的抑制效果最好，MIC为0.125 μg/mL；多西环素次之，MIC为0.5 μg/mL；其次是氟苯尼考、环丙沙星、恩诺沙星；无乳链球菌对青霉素、林可霉素耐药性严重，MIC>128 μg /mL。

表3 抗生素单药MICTable 3 MIC of single antibiotic drug

2.4 体外联合药敏试验 联合试验选择药物作用较好的阿莫西林、多西环素、替米考星、环丙沙星和氟苯尼考进行试验，试验结果见表4。

表4 体外联合药敏试验结果Table 4 Results of combined drug sensitivity test in vitro

3 讨论

在测试无乳链球菌ZQ0910对小鼠致病力的试验中，测得其LD0为15 CFU/mL，LD100为1.5×104CFU/mL， 采用Bliss法算出无乳链球菌ZQ0910的LD50为402.35 CFU/mL，并且试验组小鼠均在24 h 内发病死亡。将本试验结果与以往文献中的结果对比，推断无乳链球菌ZQ0910为强毒株，致病力强，若大范围发病将会给养殖场带来难以估量的经济损失。本试验中利用PCR检测本株无乳链球菌是否携带5个致病基因，分别为hylB、ponA、cfb、sip和cpsE，其中cpsE基因与人源、动物源无乳链球菌相似性达100%[6]。在本试验所用的菌株ZQ0910中检测出cfb、hylB、ponA，并未检测出有携带由CPS编码的cpsE基因以及sip基因，表明本菌株的致病基因中携带有hylB、cfb和ponA。有研究表明，hylB、

cfb与无乳链球菌的侵袭力相关[7]，其表达量随培养温度的升高表现出先升高后降低[8]。hylB能提高无乳链球菌在巨噬细胞内的存活能力，使其逃避宿主的免疫机制[9]；由cfb编码的膜外蛋白CAMP因子，在细菌入侵宿主细胞与抗吞噬作用等方面起重要作用[10]。

在生产应用上，抗生素以及人工合成抗菌药仍然是防治罗非鱼链球菌病的主要药物[11]，其中青霉素是治疗无乳链球菌病的首选药物[4]。本次试验所选用的抗生素除青霉素外均为广谱抗生素，青霉素、头孢噻呋和林可霉素对链霉素敏感，阿米卡星及链霉素对链球菌存在固有耐药性。在本试验中通过微量肉汤2倍稀释法测出的抗生素单药抑菌效果提示阿莫西林对罗非鱼无乳链球菌体外抑菌效果最好，多西环素次之；罗非鱼无乳链球菌对阿米卡星、链霉素、青霉素、林可霉素的单药体外抑菌试验表现出严重的耐药性。阿莫西林及青霉素同β-内 酰胺类抗生素，对细菌的作用体现在抑制其细胞壁合成，多西环素及林可霉素对细菌的作用体现在抑制其蛋白合成，上述4种抗生素存在作用机理相同但对本菌株的敏感性相差甚远的结果，青霉素及林可霉素的耐药性产生提示可能在生产中这2种药物存在滥用的情况，致使其对链球菌敏感性降低。无乳链球菌已明显表现出对首选药物青霉素存在严重的耐药性，在生产中考虑是否需要更换其他尚未表现出明显耐药性的抗生素进行治疗无乳链球菌病。体外联合药敏试验选择药物作用较好的阿莫西林、多西环素、替米考星、环丙沙星和氟苯尼考进行试验。抗生素体外联合药敏试验结果提示，环丙沙星分别联合多西环素、替米考星以及氟苯尼考的体外药敏测试结果为相加作用；阿莫西林分别联合多西环素、替米考星和氟苯尼考的体外药敏试验结果以及氟苯尼考联合替米考星的体外药敏试验结果为拮抗作用；环丙沙星联合阿莫西林的体外药敏试验结果为无关作用。阿莫西林、多西环素、替米考星以及氟苯尼考的抑菌机制相同，一般情况下相同作用机制的抗生素联用并不能提高其疗效，还有增加毒性的危险，因此，在生产中并不建议使用抑菌作用机制相同的2种抗生素在治疗时进行联合用药。

结合本试验结果，建议在罗非鱼的养殖生产中若出现无乳链球菌或其他致病菌感染时，在治疗过程中:(1)当致病菌对治疗药物明显表现出耐药性时及时更换所使用的抗菌药物；(2)加大同种药物使用的间隔周期，避免让鱼群长期接触同种抗生素；(3)确保每次用药浓度已达到其抑菌浓度，对抗生素长时间低浓度接触也可导致病原菌对其产生耐药性；(4)选择多种有效的抗生素交替使用，减缓病原菌对抗生素耐药性的产生速度；(5)减少选择药物的联合使用，决定需要联合用药时要谨慎选择所联用的抗生素。除此之外，抗生素在罗非鱼以及在水体中的残留对人类健康也有一定的威胁，可引起肠道疾病、过敏甚至食物中毒[12]，需要使用抗生素时应科学合理使用，以降低其所带来的不良影响。在防治时除了使用抗生素，也可以考虑其他方法，有研究表明，在日粮中添加白曲霉可提高罗非鱼对无乳链球菌的抵抗力[13]，阿萨姆茶的提取物可降低罗非鱼感染无乳链球菌后的死亡率[14]。在日常防治中可考虑:(1)利用相应疫苗对罗非鱼进行免疫，多次免疫效果较单次免疫效果好[15]；(2)在日粮中加入适量白曲霉进行预防，若出现无乳链球菌感染时可以考虑往日料中或鱼塘中加入适量的阿萨姆茶提取物，以降低其死亡率，减少经济损失。