副猪嗜血杆菌和PCV2共感染对猪肺泡巨噬细胞免疫分子表达的影响

郑新添 ， 林成鸿 ， 李晓华 ， 林炜明 ， 黄翠琴

(1.龙岩学院生命科学学院 ， 福建 龙岩 364000 ； 2.福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室 ， 福建 龙岩 364000)

副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,Hps)是定植于猪上呼吸道的一种常在菌，在一定条件下可侵入肺部，引起猪的格拉氏病。副猪嗜血杆菌感染引起系统性疾病，特别是断奶仔猪的系统性炎症，如浆膜炎、腹膜炎、心包炎和关节炎等[1-2]。Hps至少拥有15个血清型，其中血清4型和5型[3]是主要流行株。Hps菌株感染的多样性及与其他病原共感染，如与猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒、胸膜肺炎放线杆菌[4-6]，加剧了猪的发病，增加了防控难度[7]。肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophage，PAM)是抵抗病原体感染的重要防线，在天然免疫和特异性免疫功能发挥重要作用[8]。Hps通过黏附并侵入PAM，后者能吞噬并清除低毒力细菌，以及通过释放细胞因子和趋化因子修复宿主由于炎症引起的创伤[9]。猪圆环病毒2型是猪场普遍存在的一种病毒，可以直接或间接导致机体免疫抑制，PCV2单独感染时不产生明显症状，但其他病原微生物混合感染能加重病情[10]。Hps和PCV2共感染在猪场广泛流行，但其致病机制尚不清楚。本试验建立了体外Hps和PCV2共感染PAM模型，通过检测感染后不同时间细胞因子和抗原递呈相关分子的表达水平，以探讨Hps和PCV2共感染的致病机制。

1 材料与方法

1.1 菌株和毒株 副猪嗜血杆菌Hps LY02株(血清5型)、Hps LYH5株(血清4型)、PCV2 LY株(TCID50为10-5.0/mL)，均由福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室分离并保存。

1.2 主要试剂 总RNA提取试剂盒RNAiso Plus、反转录试剂盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit (Perfect Real Time)、实时荧光定量PCR试剂盒SYBR®PremixExTaqTMII (Tli RNaseH Plus)等，均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；细胞培养板、RPMI 1640、DMEM培养基、胎牛血清、胰酶等，均购自福州沃森生物技术有限公司。

1.3 引物 根据GenBank公布的基因序列，使用Primer 5.0设计引物序列(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 实时荧光定量PCR引物Table 1 Primers used for real-time fluorescent quantification PCR (n=12)

1.4 PAM细胞的制备 取3头4周龄健康仔猪，经PCR检测PCV2病毒阴性，ELISA检测PCV2抗体阴性，经PCR检测Hps核酸阴性，ELISA检测Hps抗体阴性。无菌条件下取其肺脏，用含0.02% EDTA 的PBS灌洗肺脏3次，每次100 mL。灌洗液经纱布过滤后300 g离心10 min，用0.01 mol/L PBS(pH 7.0)洗涤2次，最后重悬于含10%新生犊牛血清RPMI 1640培养液中。经0.2%台盼兰检测，细胞活性达95%以上，将细胞浓度调整至5×106个/mL，铺于细胞培养板，37 ℃贴壁培养2 h后弃去未贴壁细胞，用PBS清洗细胞面，37 ℃培养24 h 形成单层细胞备用。

1.5 体外感染试验设计 将PAM浓度调整至5×105个/孔，细胞分为6组，即PCV2感染组、Hps 5型感染组、Hps 4型感染组、Hps 5型+PCV2共感染组、Hps 4型+PCV2共感染组和空白对照组(Mock组)。PAM 培养2 h 后，用无菌PBS洗涤1次，加入500 μL 稀释的PCV2[感染复数(MOI) 100]，并于 37 ℃、5%CO2条件下孵育1 h，之后再用无菌PBS洗涤病毒感染的细胞2次后更换为新鲜的DMEM培养基。向PCV2感染的细胞样品中分别加入 Hps 5型和Hps 4型菌液(菌浓度均为5×107CFU/mL)，37 ℃ 孵育2 h后，弃去样品内的培养基，更换新鲜DMEM培养基继续培养36 h。分别在感染12、24 h和36 h后收集各组细胞，备用。

1.6 实时荧光定量PCR(qPCR)检测免疫相关分子mRNA的相对表达量 细胞总RNA提取按TRIzol试剂盒说明书进行，用NanoDrop-2000微量核酸测定仪检测RNA浓度。用反转录试剂盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit将RNA反转录成cDNA后，取反转录的cDNA作为模板，按照表1中的引物扩增免疫相关分子，每个样品重复3孔，进行qPCR。Real-time RT-PCR 反应体积为25 μL:SYBR®PremixExTaqTMII 12.5 μL、25 μmol/L 上、下游引物各 1 μL、 cDNA 模板2 μL、ddH2O 8.5 μL。反应程序：95 ℃ 30 s；94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共 40个 循环；72 ℃ 5 min。以β-actin为内参，采用2-△△Ct法计算各基因的相对表达量。

1.7 数据处理与统计 试验结果以平均值±标准差(Mean±SD)表示，用单因素方差分析各组数据间的差异，采用Tukey法进行多重比较，数据分析用GraphPad Prism 8.0软件完成，P<0.05表示差异具有显著性。

2 结果

2.1 PAM细胞因子的mRNA表达分析 结果如图1所示，在3个检测时间点，各感染组PAM的IL-1β和TNF-αmRNA表达水平均显著高于空白对照组(P<0.05)，IL-4和IL-10 mRNA表达水平均显著低于空白对照组(P<0.05)。与单一感染Hps或PCV2相比，Hps和PCV2共感染组促进了IL-1β和TNF-α的mRNA表达，且在12 hpi和24 hpi基因上调程度较高，而在36 hpi后，相对下降(图1A、图1B)。IL-4和IL-10的mRNA表达，在12 hpi和24 hpi基因下调程度较大，而36 hpi后下调趋势减弱(图1C、图1D)。

图1 感染Hps和/或PCV2后PAM细胞因子mRNA表达水平Fig.1 Cytokines mRNA expression levels of PAM infected with Hps and/or PCV2标有不同小写字母者表示组间差异有统计学意义(P<0.05)，标有相同小写字母者表示组间差异无统计学意义(P>0.05)；下图同Those with different lowercase letters indicated that the difference between the groups was statistically significant (P<0.05);those marked with the same lowercase letters showed no statistically significant difference between the groups (P>0.05). The same as below

Hps 5 + PCV2共感染组与Hps 4 + PCV2共感染组相比，在3个检测时间点，细胞因子mRNA表达水平差异不显著(P>0.05)。

2.2CD80与CD86分子的mRNA表达 结果如图2所示，单一感染PCV2或Hps对CD80的mRNA表达影响不显著(P>0.05,图2A)，但是在12 hpi和24 hpi显著下调了CD86的mRNA表达(P<0.05，图2B)。在12 hpi和24 hpi，Hps和PCV2共感染均显著抑制了CD80与CD86的mRNA表达(P<0.05)；在36 hpi仅有Hps 5 + PCV2共感染组的mRNA表达水平显著低于空白对照组(P<0.05)，其他组与空白对照组之间的差异均不显著(P>0.05)。

图2 感染Hps和/或PCV2后PAM的CD80和CD86 mRNA表达水平Fig.2 CD80 and CD86 mRNA expression levels of PAM infected with Hps and/or PCV2

2.3SLA-DR和SLA-DM分子的mRNA表达 结果如图3所示，在12 hpi，各组之间SLA-DM的mRNA表达差异不明显(P>0.05,图3A)，但SLA-DR的mRNA表达在Hps感染组显著低于对照组(P<0.05，图3B)；在24 hpi，单一感染组和共感染组的SLA-DR和SLA-DM的mRNA表达量均显著低于空白对照组(P<0.05)，但是单一感染组与共感染组之间差异不明显(P>0.05)。在36 hpi，共感染组表达显著低于单一感染组和空白对照组(P<0.05)；而共感染组与单一感染组差异不显著(P>0.05)，与空白对照组差异也不显著(P>0.05)。

图3 感染Hps和/或PCV2后PAM的SLA-DM和SLA-DR mRNA表达水平Fig.3 SLA-DM and SLA-DR mRNA expression levels of PAM infected with Hps and/or PCV2

3 讨论

Hps和PCV2作为猪场常见的病原体，常见于混合感染病例中，关于两者混合感染的致病机制尚不清楚。本试验通过体外模拟Hps和PCV2混合感染PAM，从主要免疫分子mRNA表达水平的角度探讨致病机制。作为一种免疫细胞，PAM可以吞噬病原，在清除病原感染中发挥重要作用。同时，PAM也是重要的抗原加工和递呈细胞，可以递呈内源性抗原和外源性抗原，其中对外源性抗原的递呈作用依赖于MHC II类分子[猪源MHC II类分子又称为猪白细胞抗原(Swine leukocyte antigen，SLA)]SLA-DR、SLA-DM以及共刺激CD86和CD80等免疫分子的表达[11]。

有文献表明，Hps或PCV2单独感染PAM，上调了促炎因子如IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表达[12-13]，Hps和PCV2共感染可以导致比单一感染更为严重的免疫抑制[14]。本试验结果显示，与单一感染PCV2或Hps相比，共感染组Hps和PCV2协同作用诱导了更高水平的促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的mRNA表达，而下调了抑炎细胞因子IL-4和IL-10的mRNA表达。由于IL-1β和TNF-α的增加，促进了PMWS的炎症反应；同时由于IL-4和IL-10是B细胞的激活因子[15]，因此推测IL-4和IL-10的mRNA表达水平的降低，导致了Hps抗体水平的下降。

CD80和CD86是T细胞活化途径的协同刺激信号，在免疫应答中起着重要的作用。报道表明，PCV2在体外感染PAM 48 h内下调CD80-CD86基因转录[16]，本试验结果也证实了这一点。此外，本试验结果显示，与对照组(Mock组)相比，在36 hpi，CD80和CD86表达下调，单一感染组的差异不显著，但是共感染组的下调差异显著，说明共感染产生了协同作用，且Hps 5型+PCV2共感染对CD80和CD86基因的下调作用更为显著。CD80和CD86的mRNA表达下调，可能有助于Hps和PCV2逃避免疫识别而在体内进行扩散和复制，从而在感染猪体内持续存在。

猪的MHC-Ⅱ类分子(SLA分子)作为抗原肽载体参与了CD4+T淋巴细胞的激活，是激活B细胞介导的体液免疫的关键分子之一。SLA 基因的表达水平与巨噬细胞等抗原递呈细胞的活性直接相关，在免疫细胞中具有较高的浓度是机体免疫水平的直接表现[17-18]。SLA-DR抗原的表达下调可能会降低机体的有效免疫应答，而SLA-DR抗原表达增加，可能会增强机体对感染发生有效免疫应答和对病原体的清除[19]。Hps感染能导致脾和肺组织中MHCⅡ类基因显著下调表达[20]，Costa-Hurtado等[21]发现，Hps毒力菌株感染后导致巨噬细胞的早期有效免疫应答(活化)被延迟。本试验发现，Hps和PCV2共感染导致SLA-DR和SLA-DM基因表达均显著下调，且Hps 5型+PCV2共感染对SLA-DR的mRNA表达下调作用更为显著。然而，本试验仅从PAM的免疫分子mRNA转录水平进行了探讨，而这些免疫分子的蛋白水平上的表达情况还需要进一步确认。