新精神活性物质4F-MDMB-BUTINACA 在斑马鱼体内的代谢

岳琳娜，向平，宋粉云，沈保华，严慧

1.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 司法部司法鉴定重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063；2.广东药科大学药学院，广东 广州 510006

新精神活性物质，又称“策划药”或“实验室毒品”，是不法分子为逃避打击而对管制毒品进行化学结构修饰得到的毒品类似物。合成大麻素类（syn⁃thetic cannabinoids，SCs）是种类最多、增长最快、滥用最为严重的一大类新精神活性物质[1]。

2-[1-（4-氟丁基）-1H-吲唑-3-甲酰氨基]-3，3-二甲基丁酸甲酯（4F-MDMB-BUTINACA）也称4FMDMB-BINACA 或4F-ADB，与合成大麻素3，3-二甲基-2-[1-（5-氟戊基）吲唑-3-甲酰氨基]丁酸甲酯（5F-ADB）结构相似，属于吲唑甲酰胺类合成大麻素类新精神活性物质，是大麻素受体1（cannabinoid re⁃ceptor 1，CB1）的激动剂[2-4]。2018 年11 月初，英国、荷兰、法国等多国向欧洲毒品和毒瘾监测中心（European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction，EMCDDA）报告了4F-MDMB-BUTINACA 的滥用情况[2]。2019年1月，德国埃尔兰根法医学研究所分析了3种缴获的、未标记的草药混合物，检测出4F-MDMBBUTINACA 成分[5]。最近，EMCDDA 又报告了几起与摄入4F-MDMB-BUTINACA 有关的死亡案例，新型合成大麻素4F-MDMB-BUTINACA 滥用日趋严重，对公共安全构成严重威胁[6-7]。

合成大麻素类化合物进入体内被广泛代谢，原形化合物通常很难在生物基质中检出，大多数化合物在尿液中以代谢产物形式广泛存在，因此需要进行代谢研究，以便对新出现的合成大麻素滥用形势进行监测。尽管有少量4F-MDMB-BUTINACA 体内和体外代谢的研究报道[2，5-6]，但对于这类物质的监测仍缺乏系统的体内分析方法和代谢数据的支撑。

斑马鱼（zebrafish）与人的基因高度相似，同源性高达87%[8-9]。斑马鱼体内有内源性CB1和CB2，具有与人类及其他哺乳动物高度相似的药物代谢的相关酶系，包括Ⅰ相代谢酶[10]和Ⅱ相代谢酶[11]，研究[12-13]结果表明，斑马鱼可作为人类代谢研究的理想实验模型。作为一个完整的生物，斑马鱼也能弥补体外模型系统在药物代谢研究方面的局限性。本研究旨在构建4F-MDMB-BUTINACA 斑马鱼体内代谢模型，建立液相色谱-高分辨质谱分析方法，探索4F-MDMBBUTINACA 在斑马鱼体内的代谢方式及代谢途径，以期为4F-MDMB-BUTINACA的鉴定提供方法和数据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

4F-MDMB-BUTINACA 标准品，质量浓度为1 mg/mL，溶剂为甲醇，购自美国Cayman 公司；甲酸、乙酸铵（纯度98%）购自瑞士Fluka 公司；乙腈、甲醇（色谱纯，纯度大于99.9%）购自美国Sigma-Aldrich 公司；实验用水为超纯水，由Mili-Q 超纯水系统（美国Millipore公司）制备。

1.2 主要仪器与装置

UltiMate 3000 UPLC 结合Q ExactiveTM组合型四极杆OrbitrapTM质谱仪以及Mass Frontier 软件购自美国Thermo Scientific 公司，配有电喷雾离子源（HESI-Ⅱ）及XcaliburTM3.1 工作站；OMNI* Bead Ruptor 24 Elite 多功能生物样品均质器购自奥然科学技术有限公司；TDZ4-WS离心机购自湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司；XW-80A 旋涡混合器购自上海医科大学仪器厂；MiniSpin高速离心机购自德国Eppendorf公司。

1.3 动物实验

将6 条成年斑马鱼（上海费曦生物科技有限公司）随机分为空白对照组和实验组，每组3条。将4FMDMB-BUTINACA 溶解于水中，实验组斑马鱼在4FMDMB-BUTINACA（1 μg/mL）药液中暴露染毒24 h后转移到清水中清洗3 次，进行样品前处理。空白对照组斑马鱼不暴露于4F-MDMB-BUTINACA，直接进行样品前处理，以排除斑马鱼体内、水中以及实验试剂对原形化合物及代谢产物的干扰。本实验已通过司法鉴定科学研究院伦理委员会的审查。

1.4 样品前处理

将斑马鱼置于2 mL 规格研磨管中，加入适量陶瓷珠及乙腈溶液300 μL，于生物样品均质器中冷冻研磨。研磨参数设置：速度6 m/s，研磨时间20 s，停留时间40 s，循环10 次。然后以14 104×g离心3 min，取上清液，经0.22 μm 聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）微孔滤膜过滤后，装入进样瓶待仪器分析。

1.5 实验条件

1.5.1 液相色谱条件

色谱柱：Eclipse Plus C18柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm；美国Agilent公司）。流动相：A相为20 mmol/L乙酸铵、5%乙腈和0.1%甲酸混合水溶液，B 相为乙腈。梯度洗脱程序：0～0.5 min，5% B；0.5～6.5 min，5%～95% B；6.5～11.5 min，95% B。流速为0.3 mL/min，进样量为10 μL，自动进样盘温度为4 ℃。

1.5.2 质谱条件

电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI），正离子模式；喷雾电压为3.5 kV；离子传输管温度为350 ℃；鞘气流量为35 arb，辅助气流量为10 arb，鞘气、辅助加热气和碰撞气均采用高纯氮气。

数据采集模式采用一级全扫描和自动触发二级扫描（full scan-dd MS2）。一级扫描数据采集参数设置：分辨率70 000，质荷比扫描范围m/z100～1 000；自动增益控制（automatic gain control，AGC）3.0×106，最大注射时间（maximum injection time，MIT）50 ms。二级扫描数据采集参数设置：分辨率17 500，AGC 1×105，MIT 50 ms，归一化碰撞能量（normalized collision energy，NCE）分别为20、40、60。

代谢产物的推断依据：m/z测量值与m/z理论值的质量偏差小于5×10-6，适当的色谱峰和保留时间，MS2质谱图中出现特征碎片离子，结合已报道的4FMDMB-BUTINACA[2，5-6]及其结构类似物[14-19]的代谢转化的文献进行斑马鱼体内所产生4F-MDMBBUTINACA代谢产物的确证。

2 结果与讨论

2.1 代谢产物结果汇总

本研究在斑马鱼体内鉴定出4F-MDMBBUTINACA的26个代谢产物，包括18个Ⅰ相代谢产物和8个Ⅱ相代谢产物。26个代谢产物的质荷比m/z测得值与理论值的质量偏差均在±5×10-6内。4F-MDMBBUTINACA 的保留时间为7.43 min，26 个代谢产物的保留时间为4.27～6.88 min，根据保留时间将26 个代谢产物标记为Md1～Md26。4F-MDMB-BUTINACA及其26 个代谢产物MS2谱图见图1～3。表1 列出了4FMDMB-BUTINACA 及其26个代谢产物的生物转化途径、分子式、m/z理论值、m/z实测值、质量偏差、保留时间以及响应强度。4F-MDMB-BUTINACA 在斑马鱼体内的代谢途径见图4。

图1 斑马鱼体内4F-MDMB-BUTⅠNACA的MS2谱图Fig.1 MS2 spectrum of 4F-MDMB-BUTⅠNACA in zebrafish

图2 斑马鱼体内4F-MDMB-BUTⅠNACA的18个Ⅰ相代谢产物的MS2谱图Fig.2 MS2 spectra of 18 phase Ⅰmetabolites of 4F-MDMB-BUTⅠNACA in zebrafish

图3 斑马鱼体内4F-MDMB-BUTⅠNACA的8个Ⅱ相代谢产物的MS2谱图Fig.3 MS2 spectra of 8 phase Ⅱmetabolites of 4F-MDMB-BUTⅠNACA in zebrafish

图4 4F-MDMB-BUTⅠNACA在斑马鱼体内的代谢途径Fig.4 Metabolic pathways of 4F-MDMB-BUTⅠNACA in zebrafish

18 个Ⅰ相代谢产物包括1 个单羟基化代谢产物（Md26），11个酯水解代谢产物（Md3、Md5、Md7、Md13、Md14、Md15、Md16、Md17、Md19、Md24、Md25），1 个羰基化结合单羟基化代谢产物（Md20），3个氧化脱氟代谢产物（Md11、Md21、Md22），2 个脱烷基化代谢产物（Md18、Md23）。8个Ⅱ相代谢产物都是葡萄糖醛酸结合物（Md1、Md2、Md4、Md6、Md8、Md9、Md10、Md12）。

2.2 酯水解

Md24 的准分子离子峰m/z为350.187 26，比原形化合物4F-MDMB-BUTINACA（m/z364.202 79）减小了14.015 53，结合其m/z为219.092 71、145.039 67 碎片离子的结构，推测其是4F-MDMB-BUTINACA 通过酯水解形成的代谢产物。

Md12的准分子离子峰m/z为526.218 93，比Md24增加了176.031 67，其m/z为145.039 67、219.092 87 的特征碎片离子与Md24一致，推测其是由Md24与葡萄糖醛酸结合得到的Ⅱ相代谢产物。合成大麻素5FADB[14]、3-甲基-2-[1-（4-氟苄基）吲唑-3-甲酰氨基]丁酸甲酯（AMB-FUBINACA）[15]和2-[1-（5-氟戊基）-1H-吲哚-3-甲酰氨基]-3，3-二甲基丁酸甲酯（5FMDMB-PICA）[16-17]的结构与4F-MDMB-BUTINACA相似，此前已有报道其最突出的代谢产物都是通过酯水解形成。与此相同，酯水解也是4F-MDMB-BUTINACA的主要生物转化方式，Md24 是斑马鱼体内最丰富的代谢产物。多名4F-MDMB-BUTINACA 吸毒者的血样或尿样中均检测到代谢产物Md24[2，5-6]，酯水解也是4F-MDMB-BUTINACA 在人体内的主要代谢途径。与Ⅱ相代谢产物相比，Ⅰ相代谢产物的检测无需经过酶水解等复杂的前处理过程，更适宜作为监测合成大麻素摄入的生物标志物，因此推荐将Md24 作为监测4F-MDMB-BUTINACA 摄入的潜在毒性标志物。

Md25的准分子离子峰m/z为348.171 11，比Md24减小了2.016 15，结合其m/z为219.092 86、145.039 70碎片离子的结构，推测其是由Md24 脱氢得到。Md25是斑马鱼体内产生的第二丰富的代谢产物，与人体内代谢研究结果相似，Md25也是4F-MDMB-BUTINACA滥用者尿样中普遍检测到的代谢产物[2，5-6]，推荐将Md25作为监测4F-MDMB-BUTINACA 摄入的潜在毒性标志物。Md25可能发生脱烷基反应生成代谢产物Md13，产生m/z为145.039 63、246.123 67 的特征碎片离子。

Md14的准分子离子峰m/z为348.190 52，比Md24减小了1.996 74，结合其m/z为145.039 79、217.096 89碎片离子的结构，推测其是由Md24 发生氧化脱氟反应得到。Md14 进一步发生脱氢反应生成代谢产物Md15，Md15 的准分子离子峰m/z为346.175 78，比Md14减小了2.014 74，其m/z为145.039 75、217.097 75的特征碎片离子与Md14一致。Md2的准分子离子峰m/z为522.206 36，比Md15 增加了176.030 58，推测其是由Md15与葡萄糖醛酸结合得到的Ⅱ相代谢产物。

Md3 的准分子离子峰m/z为364.186 55，比Md14增加了15.996 03，可能是增加了1 个O。结合Md3 的MS2谱图中m/z为145.038 94 的碎片离子，即吲唑环上未发生改变，说明羟基化位点发生在4-氟丁基烷烃侧链上，但难以确认羟基化的具体位点。

Md7和Md16的准分子离子峰m/z分别为362.170 90和362.171 02，比Md3 减 小 了2.015 65 和2.015 53。结合Md7 和Md16 的MS2谱图中分别出现的m/z为145.039 64、145.039 55 的碎片离子，说明羟基化反应均发生在烷烃侧链上，故Md7 和Md16 是两个羟基化的同分异构体，推测其中1 个是Md3 发生脱氢反应生成的代谢产物。

Md17的准分子离子峰m/z为366.182 34，比Md24增加了15.995 08，可能是增加了1 个O。结合Md17的MS2谱图中出现的m/z为145.039 49的碎片离子，说明羟基化反应发生在烷烃侧链上。Md4 的准分子离子峰m/z为542.214 17，比Md17 增加了176.031 83，推测其是由Md17 与葡萄糖醛酸结合得到的Ⅱ相代谢产物。

Md19的准分子离子峰m/z为364.166 72，比Md17减小了2.015 62，其m/z为145.039 60、237.103 29 的特征碎片离子与Md17 一致，推测其是由Md17 进一步发生脱氢反应得到。Md1 的准分子离子峰m/z为540.200 74，比Md19 增加了176.034 02，推测其是由Md19与葡萄糖醛酸结合得到的Ⅱ相代谢产物。

Md5 的准分子离子峰m/z为382.177 40，比Md24增加了31.990 14，推测是增加了2 个O，结合其m/z为253.098 10、161.034 04 碎片离子的结构，推测羟基化的发生位点是吲唑环和4-氟丁基侧链，但难以确定羟基化的具体位点。

有研究[2，5-6]在4F-MDMB-BUTINACA 吸毒者的血样或尿样中检测到代谢产物Md12、Md14、Md17、Md19、Md24 和Md25。此外，本实验中4F-MDMBBUTINACA 在斑马鱼体内产生的3 个Ⅱ相代谢产物（Md1、Md2、Md4）和6 个Ⅰ相代谢产物（Md3、Md5、Md7、Md13、Md15和Md16）均为首次发现。

2.3 氧化脱氟

Md22 的准分子离子峰m/z为362.206 48，比原形化合物4F-MDMB-BUTINACA（m/z364.202 79）减小了1.996 31，结合其m/z为145.039 64、217.096 99 碎片离子的结构，推测其是由4F-MDMB-BUTINACA 发生氧化脱氟反应得到。Md22 发生氧化反应生成丁酸代谢产物Md21，Md22 和Md21 已在多名4F-MDMBBUTINACA吸毒者血样或尿样中被检出[2，6]。

Md10的准分子离子峰m/z为538.239 32，比Md22增加了176.03284，生成了m/z为362.20721、145.03946的特征碎片离子，推测其是由Md22 与葡萄糖醛酸结合得到的Ⅱ相代谢产物。

Md11的准分子离子峰m/z为392.181 70，比Md22增加了29.975 22，结合其m/z为145.039 61、217.096 77碎片离子的结构，推测其是Md22 进一步发生氧化反应生成的羧酸代谢产物。

2.4 脱烷基化

Md23 是4F-MDMB-BUTINACA 脱烷基化产生的代谢产物，其准分子离子峰m/z为290.149 48，在MS2谱图中出现了m/z为145.039 60、230.128 71 的特征碎片离子。在吸毒者的尿样中常检测到代谢产物Md23，但生物样本中Md23 的检出不足以推断4F-MDMBBUTINACA 的摄入，因为其可以通过5F-ADB[14]、3，3-二甲基-2-[1-（4-戊烯-1-基）-1H-吲唑-3-甲酰氨基]丁酸甲酯（MDMB-4en-PINACA）[18-19]的生物转化而产生。

Md6 的准分子离子峰m/z为466.182 10，比Md23增加了176.032 62，其m/z为145.039 61、230.128 78 的特征碎片离子与Md23一致，推测其是由Md23与葡萄糖醛酸结合得到的Ⅱ相代谢产物。

Md18的准分子离子峰m/z为306.145 14，比Md23增加了15.995 66，可能是增加了1 个O。Md18 的MS2谱图中出现的m/z为161.034 71 的碎片离子，说明羟基化反应发生在吲唑环上，但难以确认羟基化的具体位点。

2.5 其他

Md26 的准分子离子峰m/z为380.199 01，比原形化合物4F-MDMB-BUTINACA（m/z364.202 79）增加了15.996 22，推测是增加了1 个O，结合其m/z为161.034 64、235.067 63 碎片离子的结构，可知羟基化发生在吲唑环上，但难以确定具体位点。Md9的准分子离子峰m/z为556.230 41，比Md26 增加了176.031 40，结合 其m/z为219.092 71、380.197 85 的特征碎片 离子，推测其是由Md26 与葡萄糖醛酸结合得到的Ⅱ相代谢产物。

Md20的准分子离子峰m/z为394.176 30，比Md26增加了13.977 29，结合其m/z为145.039 61、237.103 12碎片离子的结构，推测其是由Md26 进一步发生羰基化反应生成的代谢产物。Md8的准分子离子峰m/z为570.209 40，比Md20 增加了176.033 10，结合其m/z为394.177 98、237.103 27 的特征碎片离子，推测其是由Md20与葡萄糖醛酸结合得到的Ⅱ相代谢产物。

3 结论

4F-MDMB-BUTINACA 在人体内代谢速率较快，在尿液中基本无原形化合物检出，这为该类毒品滥用的监测和确认带来了极大的挑战。本研究采用液相色谱-高分辨质谱技术，通过近年来药物代谢研究中较为流行的斑马鱼模型，鉴定出了4F-MDMB-BUTINACA的26 个代谢产物及主要代谢途径。本研究获得的4F-MDMB-BUTINACA 体内代谢数据、开发的4FMDMB-BUTINACA 及其代谢产物的分析方法可应用于4F-MDMB-BUTINACA 的滥用监测，为司法鉴定实践中该新型精神活性物质滥用的打击和预防提供技术支持，也为临床4F-MDMB-BUTINACA 的中毒诊治提供依据。上述研究结果还需更多的实际案例予以验证。