毛发中7种常见合成大麻素类新精神活性物质的分析及应用

施妍 ，周莉英，沈保华，陈航，刘梦曦，2，向平，刘伟

1.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 司法部司法鉴定重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063；2.沈阳药科大学药学院，辽宁 沈阳 110000

近年来，含合成大麻素类物质的“娜塔莎”“小树枝”等新型毒品不断出现，在全球范围内引起了广泛的关注。合成大麻素通常与不同香料、药草或电子烟油混合，以不同存在形式逃避滥用药物管控，通过互联网、微信等渠道销售。由于这类新型毒品与传统毒品成瘾的症状不同，表现形式不一样，因此被不少吸食者误认为是“娱乐消遣品”或者“俱乐部用品”，是一种无害的消遣用品。笔者所在实验室近1 年来接收合成大麻素类相关案件数百例，其中最常见的为2-[1-（4-氟丁基）-1H-吲唑-3-甲酰氨基]-3，3-二甲基丁酸甲酯（4F-MDMB-BUTINACA）等7种合成大麻素类新精神活性物质（new psychoactive substance，NPS）。与此同时，合成大麻素滥用人群扩大，由此类物质滥用导致的急性中毒或死亡案件越来越多，对民众身体健康和公共安全产生了极大的威胁。

合成大麻素类NPS 是NPS 中更新换代速度最快的一类化合物[1]。该类化合物是传统毒品四氢大麻酚（Δ9-tetrahydrocannabinol，Δ9-THC）的类似物，其成瘾性强、价格低廉、隐蔽性强而且不易被检测，常被作为传统毒品的吸食替代品[2]。合成大麻素类NPS的作用效力比THC 强，其与大麻素受体1（cannabinoid receptor 1，CB1）、CB2结合的亲和力比THC 高80～100 倍[3-6]，滥用合成大麻素会出现头晕、呕吐、精神恍惚、致幻等反应，过量吸食会出现休克、窒息甚至猝死等情况[7-10]。

对于合成大麻素类NPS 滥用的鉴定和打击预防是当前司法鉴定领域的重要需求。尽管当前针对合成大麻素类NPS的免疫分析法有所发展，但由于特异性不足以及合成大麻素的衍生物不断出现，免疫分析法仍然受到限制[11-12]。已有文献报道分析尿液[1，13]、血液[3]和唾液[14]中合成大麻素类NPS 主要采用的方法有液相色谱-串联质谱法[15]、气相色谱-质谱法[16-17]等。毛发是监测药物滥用的重要检材，与其他生物检材相比，毛发具有易获得、易保存、分析物稳定、能反映较长时间内药物滥用情况等优点[18-19]。但目前分析毛发中合成大麻素类NPS 的样品前处理方法耗时长[20-22]。因此，本研究旨在建立简便的超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）方法同时定量测定毛发中4F-MDMB-BUTINACA 等7 种我国常见合成大麻素类NPS，并将其应用于实际案例。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

QTRAP 6500+三重四极杆线性离子阱复合质谱系统（美国AB Sciex 公司）配备AcquityTMUltra per⁃formance LC I-CLASS超高效液相色谱仪（美国Waters公司），SB-2200-T超声波清洗仪（深圳市洁盟清洗设备有限公司），JXFSTPRP-CLN 冷冻研磨仪（上海净信实业发展有限公司），XW-80A 旋涡混合器（上海医科大学仪器厂），MiniSpin 微量离心机（德国Eppendorf公司），BSA124S电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］。0.22 μm 滤膜购自国药集团化学试剂有限公司。

2-[1-（5-氟戊基）-1H-吲哚-3-甲酰氨基]-3，3-二甲基丁酸甲酯（5F-MDMB-PICA）、4F-MDMBBUTINACA、1-（5-氟戊基）-N-（2-苯基丙-2-基）-1H-吲唑-3-甲酰胺（5F-CUMYL-PINACA，SGT-25）、3，3-二甲基-2-[1-（4-戊烯-1-基）-1H-吲唑-3-甲酰氨基]丁酸甲酯（MDMB-4en-PINACA，MDMBPENINACA）、3，3-二甲基-2-[1-（5-氟戊基）吲唑-3-甲酰氨基]丁酸甲酯（5F-ADB，5F-MDMB-PINACA）、3，3-二甲基-2-[1-（4-氟丁基）吲哚-3-甲酰氨基]丁酸甲酯（4F-MDMB-BICA，4-fluoro-MDMB-BUTICA）、1-（4-氰基丁基）-N-（2-苯基丙-2-基）-1H-吲唑-3-甲酰胺（4CN-CUMYL-BUTINACA，SGT-78，CUMYL-4CN-BINACA，4CN-CUMYL-BINACA，CUMYL-CBPINACA，CUMYL-CYBINACA）对照品购自美国Cayman公司，内标N-（1-金刚烷基）-1-戊基吲唑-3-甲酰胺-d9（APINACA-d9，AKB48-d9）对照品购自美国Globio公司，甲醇（色谱纯）和乙腈（色谱纯）购自美国Sigma-Aldrich 公司，98%甲酸溶液和98%乙酸铵溶液购自瑞士Fluka 公司，超纯水由Milli-Q Advantage A10 超纯水系统（美国Millipore公司）制备。

1.2 标准溶液配制

取7 种合成大麻素类NPS 及内标对照品适量，加入甲醇配制成质量浓度为1 mg/mL 的标准物质储备液，置于冰箱中冷冻保存。再用甲醇配制成质量浓度为1 μg/mL 的含7 种合成大麻素类NPS 的混合溶液，随后用甲醇稀释成质量浓度为200、100、50、25、10 和5 ng/mL的混合工作溶液。将1 mg/mL的内标储备液用甲醇稀释成质量浓度为0.4 ng/mL 的内标工作溶液。所有工作溶液在使用前均置于-20 ℃冰箱中保存。

1.3 毛发样品及样品前处理

空白毛发样品采集自10 名无吸毒史的健康志愿者（男女性各5 名，平均年龄32.5 岁），用于制备校正曲线和质量控制（quality control，QC）样品。实际案例的毛发样品取自疑似合成大麻素类物质使用者。

将毛发样品依次用去离子水和丙酮各清洗2 次，室温下干燥，然后用剪刀将毛发样品剪成1～2 mm段。称取毛发20 mg 放入2 mL 研磨管中，加入含0.4 ng/mL APINACA-d9的内标工作溶液1 mL，在4 ℃下研磨毛发样品。研磨参数设置：速度6 m/s，研磨时间20 s，平衡时间40 s，循环10次。研磨后的样品超声10 min后以14 104×g离心5 min，取上清液，过0.22 μm滤膜，滤液直接供仪器分析。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm；美国Waters 公司）。流动相A 为20 mmol/L 乙酸铵、0.1%甲酸和5%乙腈的水溶液，流动相B 为乙腈。采用线性梯度洗脱程序：0～1 min，50% B；1～6 min，线性增加到90% B；6～9 min，保持90% B；9～9.1 min，回到初始50% B；9.1～10 min，保持50% B。流速0.3 mL/min，总运行时间10 min，进样体积5 μL。

1.4.2 质谱条件

公司拥有多台无人机和相关拍摄制作设备，项目滚动式发展，公司资金可以满足目前发展的要求，不会使项目在实施到中途因为资金问题导致违约。

采用电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）正离子模式，在多反应监测（multiple reaction moni⁃toring，MRM）模式下采集数据。ESI 参数设置如下：离子源温度500 ℃；气帘气（N2）18 psi；离子喷射电压5 000 V，碰撞室出口电压10 V、入口电压10 V；离子源气体1（GS1）40 psi，离子源气体2（GS2）35 psi。MRM参数和保留时间如表1所示。

表1 合成大麻素类NPS和内标的MRM参数和保留时间Tab.1 MRM parameters and retention times for synthetic cannabinoids NPS and internal standard substance

1.5 方法学验证

1.5.1 选择性

取10份不同来源的空白毛发样品，分别按照1.3节进行样品前处理，考察毛发样品中的内源性物质及内标是否干扰分析物的测定。

1.5.2 线性、检出限和定量限

称取20 mg 空白毛发样品，加入合成大麻素及其代谢物的混合标准溶液，配制成质量分数为1、2、5、10、20、50、100 和200 pg/mg 的加标毛发样品，按照1.3节样品前处理方法制备样品。以每个分析物的质量分数为横坐标（x），以定量离子对与内标的峰面积比为纵坐标（y），以加权最小二乘法（W=1/x）进行回归运算，得到线性方程。以信噪比（S/N）≥3 为检出限（limit of detection，LOD），以S/N≥10 为定量限（limit of quantitation，LOQ）。

1.5.3 精密度和准确度

称取20 mg 空白毛发样品，加入合成大麻素及其代谢物的混合标准溶液，配制成包括LOQ 在内的4个质量分数的QC 样品，每个浓度点制备6 个平行样品，按照1.3 节方法进行样品前处理，连续测定4 d。精密度用相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）来评估。经线性方程计算的测定值与实际添加标准样品的质量分数的百分比为准确度。要求QC样品的精密度（RSD）不超过15%，LOQ 样品的精密度（RSD）不超过20%[23]；QC 样品的准确度在85%～115%，LOQ样品的准确度在80%～120%。

根据MATUSZEWSKI 等[23]提出的方法考察基质效应和提取回收率。基质效应主要表现为离子抑制或增强作用。选取包括LOQ 在内的4 个质量分数的QC 样品，测得按照1.3 节方法处理后进样的峰面积（A），空白样品按照1.3节方法处理后加入相应质量分数的混合标准溶液进样的峰面积（B）和标准溶液的峰面积（C），用B/C计算基质效应，用A/B计算提取回收率。

1.5.5 稳定性

称取20 mg 空白毛发样品，加入合成大麻素的混合标准溶液，配制成包括LOQ 在内的4个质量分数的QC样品，每个浓度点制备6个平行样品，按照1.3节方法进行样品前处理，将提取液储存在4 ℃的自动进样器中24、48、72 h，考察常见合成大麻素类NPS 在人类毛发中的稳定性，偏倚在±15%以内，可认为样品稳定。

2 结果与讨论

2.1 方法学验证

2.1.1 选择性

10 份不同来源的空白毛发样品经样品前处理后，在待测分析物对应的保留时间处均无内源性干扰以及内标的干扰，说明该方法的选择性良好。

2.1.2 线性、LOD和LOQ

各分析物的线性范围、LOD 和LOQ 见表2。结果表明，各分析物在线性范围内线性关系良好，相关系数（r）均大于0.99，LOD 在0.5～2 pg/mg，LOQ 在1～5 pg/mg（色谱图见图1），可以满足鉴定实践的需求。

表2 毛发中7种合成大麻素的线性、LOD和LOQTab.2 The linearity，LOD and LOQ of 7 synthetic cannabinoids in human hair

图1 7种合成大麻素的提取离子色谱图（LOQ）Fig.1 Extracted ion chromatograms of 7 synthetic cannabinoids（LOQ）

2.1.3 精密度和准确度

各分析物的精密度和准确度见表3。该方法的日内精密度为0.1%～10.9%，日内准确度为89.2%～110.7%，日间精密度为2.5%～12.6%，日间准确度为94.5%～105.7%。精密度均在15%以内，准确度均在85%～115%，表明该方法的精密度和准确度良好。

2.1.4 提取回收率和基质效应

本方法的提取回收率和基质效应见表3。各分析物的提取回收率为52.3%～93.3%，均大于50%。基质效应为19.1%～95.2%，其中5F-MDMB-PICA、4FMDMB-BICA 在毛发基质中产生离子抑制，其基质效应范围为19.1%～49.9%，其他目标物受基质效应影响较小。

表3 毛发中7种合成大麻素的精密度、准确度、回收率和基质效应Tab.3 The precision，accuracy，recovery rate and matrix effect of 7 synthetic cannabinoids in human hair（%）

根据相关文献[24]报道，在毛发基质中合成大麻素类NPS存在离子抑制现象，分析物的基质效应受浓度影响较大，浓度越低越易受离子抑制影响。笔者也推测分析物在离子化过程中产生竞争关系，受分析物理化性质的影响，5F-MDMB-PICA、4F-MDMB-BICA的极性相对较小，其他分析物的极性相对较大。5FMDMB-PICA、4F-MDMB-BICA 离子化效率降低，导致离子抑制。

2.1.5 稳定性

毛发样品经提取后在4 ℃条件下保存24、48 和72 h 的偏倚分别为91.6%～111.8%、94.1%～112.7%和91.1%～113.3%（表4），表明各分析物在提取液中稳定性良好。

表4 毛发中7种合成大麻素的稳定性（偏倚）Tab.4 The stability of 7 synthetic cannabinoids in human hair（bias） （n=6，%）

续表4Continued Tab.4

2.2 案例应用

某年8 月初，王某（女，20 岁）在与几个朋友聚会后，从高层公寓楼的楼顶一跃而下。据了解，王某跳楼之前曾与一群同龄的男生一起抽电子烟。据那群男生回忆，抽了电子烟感到“很嗨”后，王某等几个人就跑到楼顶，之后她就毫无预兆地跳楼了。为了寻找王某跳楼的真相，警方委托本单位进行鉴定。运用本研究所创建的方法在王某距根部3 cm 的头发中检出合成大麻素4F-MDMB-BUTINACA 成分，质量分数为53.9 pg/mg（图2）。

图2 实际案例头发中4F-MDMB-BUTⅠNACA的色谱图Fig.2 Chromatograms of 4F-MDMB-BUTⅠNACA in human hair of an actual case

2.3 小结

本研究毛发中合成大麻素的LOD 与已有文献报道相近，均达到pg 级水平[20-22]。在实际案例中分析了1 名疑似吸毒者的距根部3 cm 的头发，按照头发1 个月长0.7～1.4 cm 的生长速度[18]，本案例毛发中检出的4F-MDMB-BUTINACA 成分可反映过去3 个月的服药情况，表明其近3 个月吸食了含合成大麻素成分的电子烟。含合成大麻素类物质的电子烟社会危害性极大，吸食后会出现幻视、幻听等严重精神症状，过量吸食会出现休克、窒息甚至猝死等情况，对身心造成不可逆的伤害。在实际检案工作中遇到类似的情况应关注合成大麻素的鉴定。

2021 年7 月1 日起，国家禁毒委员会办公室将合成大麻素类物质列入《非药用类麻醉药品和精神药品管制品种增补目录》进行整类列管，这是继整类列管芬太尼类物质后的又一次监管创新实践，对遏制合成大麻素类物质等新型毒品犯罪具有重要意义。为适应禁毒新形势，本研究建立了UPLC-MS/MS方法用于同时测定毛发中7 种常见合成大麻素类NPS。该方法灵敏度高、选择性好，样品前处理方法简单，适用于实际毛发样品的定性定量分析。