哈维氏弧菌生物膜生成的影响因素研究进展

何嘉乐，叶仕根，赵小然

（大连海洋大学农业农村部北方海水增养殖重点实验室，大连市海珍品疾病防控重点实验室，辽宁 大连 116023）

据文献[1]报道，2018 年全球鱼类、甲壳类、软体类和其他水生动物产量约1.79 亿t，首次销售额共计4 010 亿美元，其中价值2 500 亿美元的8 200 万t 产量出自水产养殖生产。总产量中1.56 亿t供人类消费，相当于人均每年供应20.5 kg。水产养殖占总产量的46%和供人类消费的鱼类的52%。中国是水产生产大国，占2018 年全球鱼类产量的35%。2019 年我国水产品总产量达到6 480.36 万t，水产品人均占有量达到46.45 kg[2]。随着水产品消费量的提高和养殖规模的扩大，由细菌引发的水产品安全问题也越发引起人们的重视。

由弧菌属病原菌引起的疾病是世界各地海水养殖经济物种的主要流行病，也是水产养殖中危害最大的细菌性疾病。其中哈维氏弧菌就是弧菌属一种常见的病原菌，具有运动性，广泛分布于海洋及河口等水生生态系统。哈维氏弧菌是虾类最常见且最严重的威胁之一，能引起对虾的烂尾病和发光病等，病虾胰腺、心脏、淋巴器官坏死，有的外骨骼出现黑色斑点，症状严重时会大量死亡。随着养殖业的发展和养殖品种的增多，哈维氏弧菌能感染的宿主范围也在逐渐扩大，除了最常见的对虾，还能感染金头鲷、鲈、大黄鱼、大菱鲆、虱目鱼等[3-6]，其中不乏名贵的养殖品种，哈维氏弧菌感染引起的疾病给养殖户造成了严重的经济损失。

生物膜是细菌黏附在介质表面后，以特定方式将代谢分泌的胞外基质（如多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等）把细菌自身包裹其中而组成的结构性细菌群落。资料显示，人类和动物被微生物感染，至少65%是由稳定的细菌群落——生物膜引起的[6]。现从哈维氏弧菌生物膜形成过程、理化因素、生物膜调控机制、生物膜耐药性、抑制生物膜形成的新药物等方面进行综述。

1 生物膜的形成过程

细菌生物膜的形成会经历四个过程：黏附、聚集、成熟、扩散。黏附是生物膜形成的初始阶段，先决条件是细菌必须足够靠近表面，此时吸引力和排斥力都起作用，最终的黏附力是由黏附因子或细菌表面的一些附属结构介导的，具有特异性和选择性。在距离表面10~20 nm 的地方，细菌表面的负电荷被大多数环境表面的负电荷所排斥，然而这种排斥又可以通过细菌细胞和黏附表面之间的范德华力以及使用菌毛和鞭毛提供表面的机械附着来克服。

当生物膜的第一层建立，相同物种或其他物种的细胞从外环境中被补充到生物膜中，进而使生物膜从一个薄层生长成一个“蘑菇”或“塔”状的结构。在厚厚的生物膜中，细菌根据新陈代谢和空气耐受性排列[7]。例如，厌氧菌更喜欢生活在更深层次以免暴露在空气中。随着细菌的聚集、增殖以及细菌间的群体感应带来的调节，生物膜趋于成熟，被包埋在生物膜中的细菌分泌更多的胞外物质（如蛋白质、脱氧核糖核酸、多糖）从而使生物膜的“支架”形成，最终生成结构复杂的成熟生物膜。在此阶段，生物膜达到稳定状态，对环境有着最强的抗性[8]。

在生物膜成熟阶段之后是扩散阶段，这也是生物膜生命周期的关键阶段。当生物膜达到一定的临界质量时，营养物质的缺乏、竞争的激烈、细菌数量增长过快等多种因素引起了生物膜的扩散。这种现象可能是一个完整的生物膜发生扩散，也可以只是其中一部分发生扩散。当稳态生物膜形成时，最外层的细菌可以脱离生物膜并变成浮游细菌，这些浮游细菌能够定居在新的介质表面上。浮游细菌的释放促进了新的生物膜在其他介质表面其他部位的生成[9]。

2 影响哈维氏弧菌生物膜形成的理化因子

生物膜的发育与成熟会受到很多因素的影响，包括生物因素、化学因素和物理因素，如pH 值、温度和生物膜黏附介质的性质等。

2.1 菌液浓度

李海平等[10]和吴同垒等[11]的研究表明，哈维氏弧菌的黏附量与菌液浓度相关且呈正比关系。浮游细菌密度较低时，初期黏附在基质表面的细菌量较少，当菌液浓度升高时，生物膜形成量较大。因此，细菌黏附促进了生物膜的形成，而细菌的黏附量会随着菌液浓度的升高而增加。

2.2 pH 值

哈维氏弧菌在pH 值为5.5~9.0 时，均可生成生物膜，pH 值 6.0~7.5 时，生物膜的形成最明显，pH值为7 的时候，生物膜形成量达到最大，pH 值大于8 或小于6 的时候，生物膜的生成会受到抑制，且碱性环境的抑制效果更为显著[10]。吴同垒等[11]的研究表明，哈维氏弧菌在pH 值为2~10 时，都能形成生物膜，而在pH值为8 时，形成的生物膜量最大，这与李海平等[10]研究结果一致。

2.3 温度

当温度为4~15 ℃时，哈维氏弧菌几乎不生成生物膜，达到20 ℃时开始生成生物膜，30 ℃时达到顶峰，随着温度升高生物膜的生成量又开始下降[10]。吴同垒等[11]的试验也验证了这一结果，25~35 ℃时为哈维氏弧菌形成生物膜的最适温度。

2.4 渗透压

w（NaCl）为1%~5%时，哈维氏弧菌的成膜量逐渐增加，为5%时达到最大，大于5%时成膜量又呈下降的趋势，为0 和8%时几乎不能形成生物膜[10]。吴同垒等[11]的研究中使用的哈维氏弧菌，在w（NaCl）为 2%~8%时，均可形成生物膜，为 0 时，几乎不能形成生物膜。

3 哈维氏弧菌生物膜形成的调控机制

3.1 c-di-GMP

第二信使环二鸟苷酸（c-di-GMP）是一种广泛保守的细胞内信号分子，对于控制不同细菌物种的生物膜形成、黏附、运动性、毒力和细胞形态都是十分重要的。c-di-GMP 是由两个GTP 分子在腺苷酸环化酶（DGC）的催化作用下合成的，DGC 酶中的结构域GGDEF 是产生该催化作用的活性中心。c-di-GMP 在PDE 酶（磷酸二酯酶类）的作用下降解，起主要酶活性的是EAL 结构域（或者叫HD-GYP 结构域）[12]。在许多细菌中，c-di-GMP 通过调节各种细胞过程来实现游离和静止两种生活方式之间的转换。一般来说，细胞内高浓度的c-di-GMP 促进EPS（胞外多糖）的产生、生物膜的形成和粗糙度增加，同时抑制运动性和毒力基因的表达[13]。

2002 年，由 Boles 等[14]研究副溶血性弧菌和D’argenio 等[15]研究铜绿假单胞菌时，首次提出了cdi-GMP 在控制生物膜形成中的作用，当时他们确定了编码GGDEF 和EAL 结构域蛋白的基因，这些基因在突变或过度表达时会影响生物膜的形成。Tischler 等[16]发现，在霍乱弧菌中过度表达分离的GGDEF 结构域会导致编码霍乱弧菌胞外多糖（VPS）的vpsA-Q 基因表达增加，同时伴随着c-di-GMP水平的增加，而分离的EAL 结构域的过度表达则达到相反的效果。

c-di-GMP 水平的增加往往会促进生物膜的形成或抑制鞭毛的运动。弧菌比其他细菌含有更多的DGC 和PDE，这些丰富的控制c-di-GMP 合成和降解的酶表明了c-di-GMP 信号在弧菌生物学中的重要性。弧菌属其他弧菌的c-di-GMP 研究与哈维氏弧菌相比较为深入，例如副溶血弧菌和霍乱弧菌的c-di-GMP 受到操纵子 scrABC 和 scrG 的调控[17]，PilZ 结构域蛋白可以作为c-di-GMP 受体在霍乱弧菌和其他弧菌中调节c-di-GMP 依赖的过程[18]等。虽然每种弧菌的调节路线各有差别，但弧菌具有相似的调节蛋白和信号系统，对哈维氏弧菌的c-di-GMP 研究来说也具有很大的参考价值。

3.2 群体感应系统

决定细菌生物膜形成能力的另一个重要因素是群体感应（quorum sensing, QS）。群体感应是细菌群体通过称为自动诱导因子（AI）的小分子进行交流的一个过程。这种交流过程使细胞通过改变信号分子的阈值浓度来改变基因表达，从而同步协调它们在群体中的行为。

哈维氏弧菌对三种不同类型的AI 产生反应，这些信息被导入一个磷链级联。第一种AI 是HAI-1，由合酶LuxM 合成的一种酰化高丝氨酸内酯[N-（3-hydroxybutyryl）-homoserine lactone]，是哈维氏弧菌特有的信号分子[19]。第二种是AI-2，由LuxS 合成的一种呋喃糖基硼酸双酯，因为多种细菌都可产生，所以被认为是一种全局信号分子[20]。第三种是CAI-1，由CqsA 产生的一种长链氨基酮[（Z）3-aminoundec-2-en-4-one]（Ea-C8-CAI-1），对弧菌属成员具有特异性[21]。这些AI 遵循不同的合成模式，每个AI 的浓度根据生长阶段而不同。AI-2 的浓度在指数生长期增加，但HAI-1 和CAI-1 只有在指数生长期后期才能检测到[22]。HAI-1、AI2 和CAI-1被3 种不同的受体感知，分别是杂合组氨酸激酶LuxN、LuxQ（以及周质结合蛋白LuxP）和CqsS。这些膜结合受体由一个递质结构域组成，包括具有二聚化和组氨酸磷酸转移结构域（DHp）和一个催化ATP 结合的结构域（CA）。

在低细胞密度和低AI 浓度时，受体充当激酶，自身磷酸化，随后将磷酸基团转移至受体的天冬氨酸盐中；接着，该磷酰基被转移至组氨酸磷酸转移蛋白LuxU，LuxU 将天冬氨酸残基上的响应调节剂LuxO 磷酸化[23]。P-LuxO 被激活，并与 σ 因子一起诱导5 个小调节RNA（Qrr1-5）的转录。这些sRNA 和RNA 伴侣Hfq 共同作用，最终破坏并降解主要调控因子luxR 的mRNA，该调控因子通过将QS 维持在关闭状态来调节其QS 表型[24]。在高细胞密度时，AI-2 与 LuxP 结合，LuxQ 作为磷酸酶使 LuxO 去磷酸化[25]。由于LuxO 的失活，下游诱导Qrr1-5 的级联反应被抑制。因此，luxR 的mRNA 保持稳定，从而维持着LuxR 的蛋白水平，LuxR 与产生并诱导生物发光、生物膜形成[26]的基因有关。LuxR 负责在细胞从低细胞密度向高细胞密度转变的过程中重新配置基因表达，是一个关键但复杂的全局调节因子。因此，抑制AI-2 系统的化合物对于控制细菌毒力和生物膜形成是很重要的。

此外，哈维氏弧菌的QS 级联反应包括5 个反馈环[27]。①LuxO 和LuxR 通过与相应的启动子区域结合，负调控自己的转录。②LuxR 直接激活sRNA的转录。③sRNA 反过来通过隔离的方式控制luxO和mRNA。④luxMN 的翻译受到sRNA（Qrr1-5）的负调控。⑤另一个主要调控因子AphA 在低细胞浓度时被诱导，并诱导Qrr1-5 的表达。在副溶血弧菌和霍乱弧菌中也存在AphA，且二者高度同源，功能高度相似，在副溶血弧菌和霍乱弧菌中AphA 间接抑制scrABC 和scrG 的表达是其促进c-di-GMP 合成及生物膜形成的机制之一[28-29]，在此可推测AphA在哈维氏弧菌中可能有着相似的作用。

4 生物膜与耐药性

养殖中抗菌药物的使用使许多病原菌耐药性的问题日益严重，有研究发现，水产养殖环境中分离得到的哈维氏弧菌对头孢菌素类以及新型β-内酰胺单酰胺环类的多种抗生素具有耐药性[30]。从韩国西海（包括贝类养殖场附近）采集的海水中分离并鉴定了2 株哈维氏弧菌，这两个分离株对先锋霉素、万古霉素、氨苄西林、头孢吡肟、头孢替坦和链霉素具有耐药性[31]。此外，有研究者[4]从大黄鱼病料中分离得到54 株哈维氏弧菌，所有的分离株均对硫酸粘杆菌素、庆大霉素、四环素、氨苄西林、复方新诺明和阿莫西林6 种抗生素呈现高度耐受，对多种抗生素的耐药率都在72.2%以上，耐药性较为严重。

生物膜的存在使细菌对微环境压力和抗菌药物的耐受性均有所增强[32]。有研究表明[33]，成熟生物膜的形成是细菌耐药性产生的关键因素之一，抗生素可以杀灭生物膜表面的细菌，但不能穿透生物膜杀灭其内部细菌，因此抗生素对生物膜的杀菌效果虽不明显但可显著抑制生物膜的扩散和细菌的分裂增殖。现在普遍认为生物膜的耐药方式主要有3种[34]，一是生物膜黏附物质的屏障作用，二是细菌生物膜内部微环境的调节，三是生物膜中基因表型的改变。除此之外，产生QS 信号、分泌抗生素水解酶、启动抗生素外泵系统、激活应激反应、对抗机体免疫防御机制等因素都在生物膜耐药性形成中发挥了一定作用。

5 生物膜抑制

5.1 天然有效成分

天然有效成分在细菌耐药性严重的背景下具有重要的作用。Kulwadee 等[35]研究的Gracilaria fisheri 乙醇提取物不仅可以减少哈维氏弧菌生物膜的生物量，而且显著破坏成熟生物膜的结构，还通过干扰AI-2 显著抑制哈维氏弧菌的发光。Jothipandiyan 等[36]发现芳樟醇和木犀草素在亚抑制浓度下均能抑制生物膜的形成，这两种化合物可破坏大约60%~70%的成熟生物膜，同时减少了哈维氏弧菌生物膜基质中EPS 的生成，且均能抑制哈维氏弧菌QS 介导的群集运动和游动。Ramesh 等[37]的研究中，十一酸分别与吲哚乙酸和吲哚丁酸联合使用可有效阻止哈维氏弧菌的初始附着及微菌落的形成，也可破坏成熟的生物膜并抑制了哈维氏弧菌的生物发光和群集运动；此外，实时PCR 分析显示，主调控子 luxO、luxQ、luxR和luxS 在药物处理后表达下调。Aqawi 等[38]研究发现大麻酚可抑制哈维氏弧菌QS 调控的生物发光和生物膜的形成，在不影响细菌生长的药物浓度下，大麻酚降低哈维氏弧菌运动性的效果，呈现出剂量的依赖性。大麻酚增加了LuxO 的表达和活性，使luxR 的表达下调80%；研究也证明了大麻酚干扰了AIs 的传递，抑制QS 级联进而干扰了哈维氏弧菌生物膜的生成。这些研究表明，还有更多的天然有效成分值得人们去探索关注，从而研发新型生物膜抑制剂和抗菌药。

5.2 噬菌体

自20 世纪初以来，噬菌体一直被用来治疗细菌感染，并被证明可以减少细菌生物膜的形成[39]，例如，噬菌体T4 可以在大肠杆菌生物膜内感染和复制，并通过杀死细菌细胞来破坏生物膜的形态。由于噬菌体具有特异性、高效和不影响共生菌群的优点，近年来噬菌体作为一种生态友好的抗生素替代品用来抵御水产养殖中的病原体。在对哈维氏弧菌引起的大菱鲆腹水病的噬菌体治疗研究中观察到两种噬菌体的混合物可以作为抗生素的替代品，分别含有与宿主细胞裂解有关的穿孔素、内溶素和裂解酶，两种噬菌体的混合物比分别单独使用都更有效[5]。多噬菌体混合被认为是扩大噬菌体寄主范围的有效方法。此外，酶降解EPS 组分是破坏生物膜的另一种有用的策略，关于携带有多糖解聚酶的天然裂解噬菌体的报道表明，在自然系统中，噬菌体诱导的细胞裂解和EPS 的降解相结合可用来减少细菌生物膜[5，39]。

6 展望

生物膜是细菌难以清除、在临床上引发慢性及持续性细菌感染的重要原因，现如今细菌耐药性在全世界日益严重，对抗菌药的有效替代品的需求日益增加。无论减少EPS 的生成或促进其降解，还是抑制QS 的级联，寻找调控生物膜关键基因的抑制剂将有望减弱细菌的抗逆能力，从而降低其致病力。由于生物膜的形成过程复杂，参与因素较多，所以近年来对生物膜的研究也更多样化，每一个参与生物膜形成的必要因素均可能成为攻克生物膜的突破点。在抗生物膜制剂方面，未来还有更广阔的研究内容等着科研工作者去探索。