血清NLRP3蛋白水平对成人癫痫患者短期内再发风险的预测价值

刘睿，郭翀，彭江涛，胡忠波，郭科，张鑫帆，吴淑华，李建民

(1.滨州医学院附属医院 神经外科，滨州 256603；2.滨州医学院附属医院 病理科，滨州 256603)

癫痫是最常见的中枢神经系统疾病之一，表现为慢性反复发作性短暂脑功能失调。约三分之一的癫痫患者对传统抗癫痫药物产生耐药，严重和控制不良的癫痫患者会出现丛集性发作并在短期内再发，增加患者躯体及脑损伤的风险，并导致其沉重的医疗负担[1]。识别短期内癫痫再发患者，及时提供干预，可以帮助他们改善病情[2]。然而，临床上目前尚无有效的生物学标志物可用于短期内癫痫再发人群的预估。癫痫的发病机制复杂，新近研究表明，多种炎症介质在癫痫的发生发展过程中发挥关键作用[3]。其中，NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domain-containing protein 3， NLRP3)炎症小体的作用引起了人们的关注。NLRP3炎症小体主要由NLRP3蛋白、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和磷酸化的Caspase-1前体组成[4]。NLRP3炎症小体是免疫炎症反应的重要组成部分，通过激活炎症相关通路，促进炎症反应的级联放大。NLRP3炎症小体及其下游炎症介质活化的Caspase-1和IL-18在脑缺血再灌注损伤、阿尔兹海默病等神经系统疾病中均有明显的促炎作用。最新研究表明，NLRP3炎症小体在急性癫痫模型中表达水平升高[5]。本课题组的前期研究也证明，慢性癫痫大鼠脑组织中NLRP3蛋白、Caspase-1和IL-18表达水平升高，抑制其表达可以降低癫痫发作强度，起到神经保护作用[6]。但NLRP3水平与短期内癫痫再发的关系尚未见明确报道。本研究通过分析成人癫痫患者外周血中NLRP3水平与短期内癫痫再发的关系，探究NLRP3水平对短期内疾病再发的预测价值，以期为临床提早识别及防治癫痫发作提供可能的生物标志物。

1 资料与方法

1.1 研究对象收集2018年9月—2019年8月滨州医学院附属医院收治的成人全面强直-阵挛性癫痫发作患者61例。其中，男性35例，女性26例，年龄(57.56±13.06)岁。入选标准：(1)年龄18周岁以上，于癫痫发作24 h内就诊。(2)根据家属描述，患者发病年龄21～83岁，发病时出现发作性意识丧失，伴四肢强直-阵挛性发作，结合既往癫痫发作史及入院后影像学和脑电图检查，所有患者病情均符合2017年国际抗癫痫联盟制定的《癫痫诊治指南》中相关诊断标准[7]，均为癫痫全面强直-阵挛性发作。(3)排除癫痫发作前有严重心、肺、肝、肾功能障碍等疾病的患者及拒绝参加研究者，不能配合完成随访者。(4)入院患者均为急性发作入院，非丛集性发作癫痫患者给予口服丙戊酸钠或卡马西平治疗[丙戊酸钠服用剂量为0.2 g/次，3次/d；卡马西平0.1 g/次，3次/d；观察期间(7 d内)持续服药]。丛集性发作癫痫患者给予苯巴比妥钠注射治疗(苯巴比妥钠注射液100 mg，肌注，早晚各1次，连续治疗2 d；后改为1次/晚，连续治疗3 d后停用)，同时给予口服或鼻饲丙戊酸钠(0.2 g/次，3次/d)或卡马西平(0.1 g/次，3次/d)[观察期间(7 d内)持续服药]。研究均获得受试者或其家属知情同意，本研究获得滨州医学院附属医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 一般资料的采集 详细记录入选患者临床资料，包括性别、年龄、实验室检查结果[NLRP3水平、血糖、血钙、血镁、白细胞(white blood cell， WBC)计数、胆固醇、尿酸]和癫痫分型(丛集性发作或短期内癫痫再发)。

1.2.2 丛集性发作及短期内癫痫再发作的判定 根据临床症状、脑电图及影像学检查结果，患者24 h内发作1次为非丛集性发作；24 h内发作≥2次为丛集性发作[8]。所有患者均经住院观察或门诊随访7 d，第1次癫痫发作后7 d内再次发作判定为短期内癫痫再发。

1.2.3 患者血清NLRP3蛋白水平的检测 入院后采集患者空腹静脉血5 mL，以1 500×g离心10 min后分离上清液，ELISA检测血清样本中NLRP3蛋白水平。具体为向包被鼠抗人NLRP3单抗的微孔中依次加入患者血清，再与兔抗人/小鼠NLRP3-HRP抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经彻底漂洗后加入底物3，3＇，5，5＇-四甲基联苯胺(3，3＇，5，5＇-tetramethylbenzidine， TMB)显色。用酶标仪检测光密度D(450 nm)值，通过标准曲线计算样本中NLRP3蛋白浓度(上述所用人NLRP3 ELISA检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司)。

2 结果

2.1 成人癫痫患者再发组与未再发组一般资料、实验室检查结果及NLRP3水平比较61例成人癫痫患者中，丛集性发作者30例，非丛集性发作者31例；随访7 d，有13例癫痫患者再次发作，其中丛集性发作者10例(76.92%)，非丛集性发作者3例(23.08%)；再发组与未再发组癫痫患者比较，性别、血糖、血钙、血镁、WBC计数、胆固醇和尿酸等指标比较差异无统计学意义(均P>0.05)；2组之间丛集性发作率、年龄、NLRP3炎症小体水平的差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01，P<0.05，表1)。

表1 成人癫痫患者短期再发组与未再发组一般资料、实验室检查结果及NLRP3炎性小体水平比较

2.2 丛集性与非丛集性发作癫痫患者NLRP3水平及疾病短期再发率的比较丛集性发作癫痫患者NLRP3水平、癫痫短期再发率均显著高于非丛集性发作癫痫患者(均P<0.05，表2)。

表2 丛集性与非丛集性发作癫痫患者NLRP3水平及疾病短期再发率的比较

2.3 成人癫痫后短期内再发影响因素的多因素Logistic回归分析以成人癫痫后短期内再发情况为因变量，上述具有统计学差异的相关指标(年龄、丛集性发作率、NLRP3水平)为自变量，进行多因素Logistic回归分析。结果显示，血清NLRP3水平及年龄是成人短期内(≤7 d)癫痫再发作的独立危险因素(OR值分别为1.104、0.925,95%CI1.021～1.193、0.871～0.982,均P<0.05, 表3)。

表3 患者短期内癫痫再发影响因素的多因素Logistic回归分析

2.4 NLRP3水平预测成人癫痫患者短期内再发的价值NLRP3水平预测成人癫痫后短期内再发的AUC为0.769，95%CI0.608～0.931，截止值91.47 μg/L，敏感度84.6%，特异度64.6%；NLRP3水平预测非丛集性癫痫患者短期内再发的AUC为0.929，95%CI0.827～1.031，截止值94.62 μg/L，敏感度100.0%，特异度85.7%；NLRP3水平预测丛集性癫痫患者短期内再发的AUC为0.675，95%CI0.448～0.902，截止值98.85 μg/L，敏感度60.0%，特异度25.0%。详见图1。

注：A. NLRP3炎症小体水平预测总体癫痫患者短期内再发的ROC曲线；B. NLRP3炎症小体水平预测非丛集性癫痫患者短期内再发的ROC曲线；C. NLRP3炎症小体水平预测丛集性癫痫患者短期内再发的ROC曲线。图1 NLRP3炎症小体水平预测成人癫痫患者短期内再发的ROC曲线

3 讨论

癫痫是一种多危险因素并具强烈遗传倾向的复杂病症[9]，大约每27人中就有1人在一生中的某个时候癫痫发作。癫痫患者过早死亡的风险很大，多达三分之一的过早死亡直接(如癫痫持续状态、癫痫所致脑损伤、癫痫所致猝死)或间接(如吸入性肺炎、自杀、溺水)与癫痫相关[10]，然而近乎一半的癫痫患者在目前的治疗方案下病情没能得到充分缓解[11]。一旦首次发作，癫痫将会对患者产生巨大的心理和生理影响。所以在初发后，迫切需要对患者病情进行适当的评估和干预。但在一般人群中，癫痫治疗后的复发率差异很大。有文献证明，局灶性发作、夜间发作、脑损伤既往史、癫痫家族史、神经系统检查异常、脑电图癫痫样放电和神经影像学异常都预示着癫痫再发风险的增加[12-13]。然而，对成人癫痫患者短期内(≤7 d)再发风险生物学标志物的探寻尚未见明确报道。

癫痫的发病机制复杂，越来越多的证据表明，脑内的炎症反应过程可能是导致癫痫病理生理变化的1个重要机制[14-15]。炎症介质可以通过激活特异性信号转导通路受体如N-甲基-D-天冬氨酸受体和TLR而触发神经元过度兴奋，最终导致癫痫发作及再发的可能性增加[16]。NLRP3炎症小体是目前研究的热点，它是免疫炎症反应的重要组成部分，能识别内源性危险信号并激活Caspase-1，继而活化IL-1β等细胞因子，参与诸多慢性疾病的非感染性炎症反应过程[17]。有研究证实，中枢神经系统中NLRP3主要定位于小胶质细胞，其被激活后形成NLRP3炎症复合体，触发和促进炎症反应过程并诱导程序性细胞死亡。癫痫发作又加重了血脑屏障的损伤，促进了脑部炎症反应，星形胶质细胞和小胶质细胞被激活，释放炎性细胞因子如IL-1β，进一步降低癫痫发作阈值，进而导致大脑的兴奋性增加和癫痫的反复发作[18-19]。因此，作者推测NLRP3炎症小体可能对短期内癫痫再发风险具有预测价值。而本研究结果也证实，成人短期内癫痫再发组血清NLRP3水平较非再发组显著升高(P<0.05)；多因素Logistic回归分析也显示，NLRP3水平是成人癫痫患者短期内再发的独立危险因素。它预测成人癫痫后短期内再发的AUC为0.769，95%CI0.608～0.931，截止值91.47 μg/L，敏感度84.6%，特异度64.6%。上述结果说明，NLRP3水平可以较好地预测成人短期内癫痫再发风险。

癫痫丛集性发作的定义为24 h内癫痫发作≥2次，患有未经治疗的丛集性癫痫的患者生活质量明显下降，癫痫持续状态、急诊和住院风险更大，其癫痫再发率也更高[20]。本研究也证实，丛集性发作癫痫患者血清NLRP3水平[(95.66±13.76) μg/L]、短期再发率(33.33%)均显著高于非丛集性发作癫痫患者[(87.85±7.90) μg/L、再发率9.68%](均P<0.05)，这说明丛集性发作的患者体内炎症反应水平升高，导致短期内再发的可能性显著增加(均P<0.05)。然而，多因素Logistic回归分析显示丛集性发作不是成人癫痫患者短期内再发的独立危险因素，而且NLRP3水平预测非丛集性癫痫后短期内再发的AUC为0.929，预测丛集性癫痫后短期内再发的AUC为0.675。作者推测这可能与病例数相对较少，且丛集性癫痫发作患者入院时病情相对较重有关。此外，应用长效抗癫痫药物苯巴比妥钠对后续疾病发作有所影响，从而影响NLRP3预测癫痫后短期内再发的精确性。

另外，研究显示癫痫再发组年龄小于癫痫非再发组，多因素Logistic回归分析也显示年龄是成人癫痫患者短期内再发的的独立危险因素(P<0.05)，需要引起重视。本研究认为，这可能与年龄小者大多为原发性癫痫，病情与病史长、熬夜、疲劳、服药不规律，而年龄大者多为卒中后癫痫有关。有研究表明，NLRP3激活剂包括胆固醇和尿酸结晶，子痫前期患者血清总胆固醇和尿酸水平升高[21]。但本研究结果显示癫痫再发组和未再发组患者血清胆固醇和尿酸水平未见明显异常。由于病例数相对较少，未能对胆固醇或尿酸针对NLRP3炎症小体的影响进行深入分析。

本研究不足之处是研究病例数相对较少，观察时间短，对NLRP3水平检测的时间点不够多，未能完整地展现出患者再发癫痫前后的NLRP3水平变化曲线。同时，样本既包括原发性癫痫，也包括继发性癫痫，其NLRP3炎症小体的激活机制可能不同。另外，纳入患者均为入院患者，而门诊患者被排除在外，这些患者病情相对较重，对短期癫痫再发的发生率可能也有影响。

综上所述，NLRP3水平升高是成人癫痫患者短期内再发的重要危险因素，对短期内癫痫再发具有一定的预测价值。NLRP3可能是新的癫痫治疗靶点，临床上其检测简便易行，具有较大的实用价值，值得应用及推广。