依托考昔抑制SDF-1/CXCR4信号通路影响骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡及炎性因子表达

王雷，余德涛，邢祯全

(三亚市人民医院 脊柱关节外科，三亚 572000)

骨关节炎是临床常见的一种关节软骨退行性病变，主要症状为关节畸形、关节疼痛等，常发生于老年人群。研究发现，炎性因子分泌量增加可影响滑膜细胞及软骨细胞释放其他介质而导致软骨细胞凋亡，软骨细胞增殖、凋亡异常可促进骨关节炎的发生[1-4]。依托考昔具有消炎镇痛的功效，可治疗骨关节炎[5]。但关于依托考昔治疗骨关节炎的作用机制尚未完全阐明。基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor 1，SDF-1)/CXC趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)信号通路在骨关节炎发生过程中发挥重要的调控作用，阻断SDF-1/CXCR4信号通路或许能作为治疗骨关节炎的新方向[6]。但依托考昔是否可通过调控SDF-1/CXCR4信号通路而影响骨关节炎的发生尚未阐明。因此，本研究主要探讨依托考昔对骨关节炎软骨细胞凋亡和炎性因子表达的影响及其对SDF-1/CXCR4信号通路的调控作用，以期为研究依托考昔治疗骨关节炎的作用机制奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 研究对象 选取2018年1—12月于三亚市人民医院进行全膝关节置换手术的骨关节炎患者12例为研究对象，其中男性8例、女性4例，年龄(56.35±6.35)岁，取出患者关节软骨片置于含有10%FBS的DMEM培养液内保存。本研究通过医院伦理委员会的批准，研究对象均知情同意。

1.1.2 试剂 依托考昔购自湖北鸿鑫瑞宇精细化工有限公司；DMEM培养液购自Gibco公司；FBS购自杭州仟诺生物科技有限公司；胰蛋白酶购自广州达晖生物技术股份有限公司；Ⅱ型胶原酶购自Sigma公司；MTT购自生工生物工程(上海)股份有限公司；细胞凋亡检测试剂盒购自北京群晓科苑生物技术有限公司；TNF-α、IL-1β检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；TRIzol试剂购自Invitrogen公司；反转录与荧光定量检测试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；兔抗人未剪切的Caspase-3(pro-Caspase-3)、活化的Caspase-3(cleaved Caspase-3)抗体购自Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔二抗购自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 人骨关节炎软骨细胞的原代培养 采用PBS洗涤骨关节软骨组织，剪碎(体积1 cm3)，加入0.25%胰蛋白酶室温消化30 min，弃胰蛋白酶消化液，加入0.2%Ⅱ型胶原酶室温消化18 h，每隔8 h收集1次细胞，使用200目滤网过滤，将细胞转移至离心管内，在4 ℃条件下以111.9×g离心10 min，弃上清液，加入含有20%FBS的培养液重悬细胞，将细胞接种于细胞培养瓶内培养，换液(每天3 次)，待细胞生长密度达到80%时使用0.25%胰蛋白酶消化，加入培养液制备细胞悬液，细胞传代，收集第3代细胞进行后续试验[7]。

1.2.2 药物处理及试验 分组取处于对数生长期的骨关节炎软骨细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后加入DMEM培养液制备细胞悬液，调整细胞密度为2.5×104个/mL，并将其接种于96孔板(100 μL/孔)，分别加入浓度为12.5、25.0和50.0 ng/mL的依托考昔处理24 h[8]，分别记作依托考昔低剂量组、依托考昔中剂量组、依托考昔高剂量组。同时将正常培养的细胞作为对照组。

1.2.3 细胞增殖的MTT检测 取处于对数生长期的骨关节炎软骨细胞，按照“1.2.2”分组处理，加入MTT溶液20 μL培养4 h，弃上清液，加入二甲基亚砜150 μL，室温避光孵育5 min，应用酶标仪检测各孔的光密度[D(490 nm)]值，计算细胞存活率。细胞存活率=(各试验组D值-空白对照组D值)/(正常对照组D值-空白对照组D值)×100%。

1.2.4 细胞凋亡率的FACS检测 收集各组处于对数生长期的骨关节炎软骨细胞，用预冷PBS洗涤，在4 ℃条件下以111.9×g离心5 min，弃上清液，向细胞沉淀中加入500 μL结合缓冲液悬浮细胞，分别加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)，充分混匀，室温避光孵育20 min，检测细胞凋亡率。

1.2.5 TNF-α、IL-1β水平的ELISA检测 收集各组细胞培养上清液，采用ELISA检测TNF-α、IL-1β的水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.6SDF-1、CXCR4 mRNA表达水平的qRT-PCR检测 收集各组处于对数生长期的骨关节炎软骨细胞，采用TRIzol法提取细胞中的总RNA。应用Nanodrop2000c超微量分光光度计检测RNA浓度。使用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR，严格按照试剂盒说明书进行操作。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成(表1)。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算SDF-1、CXCR4 mRNA相对表达量。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.2.7 pro-Caspase-3、cleaved Caspase-3蛋白表达的Western blotting检测 收集各组处于对数生长期的骨关节炎软骨细胞，加入适量RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30 min，提取细胞总蛋白。用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法检测蛋白浓度，SDS-PAGE分离蛋白，转膜，封闭，加入pro-Caspase-3(1∶800)、cleaved Caspase-3(1∶800)与内参GAPDH一抗稀释液(1∶1 000)，在4 ℃条件下孵育24 h，用TBST洗涤，分别加入二抗稀释液(1∶2 000)，滴加增强型化学发光试剂显影，应用ImageJ v 1.8.0软件分析蛋白条带灰度值。

2 结果

2.1 依托考昔对骨关节炎软骨细胞增殖及凋亡的影响与对照组比较，依托考昔低剂量组、依托考昔中剂量组、依托考昔高剂量组细胞存活率显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，且依托考昔低剂量组、依托考昔中剂量组、依托考昔高剂量组间细胞存活率及细胞凋亡率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图1、图2和表2。

图1 依托考昔对骨关节炎软骨细胞凋亡率的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；与依托考昔低剂量组比较，#P<0.05；与依托考昔中剂量组比较，△P<0.05。图2 各组骨关节炎软骨细胞活性的比较

表2 各组骨关节炎软骨细胞存活率及凋亡率的比较

2.2 依托考昔对骨关节炎软骨细胞中Caspase-3的影响与对照组比较，依托考昔低剂量组、依托考昔中剂量组、依托考昔高剂量组pro-Caspase-3蛋白水平显著升高(P<0.05)，cleaved Caspase-3蛋白水平显著降低(P<0.05)，且依托考昔低剂量组、依托考昔中剂量组、依托考昔高剂量组pro-Caspase-3、cleaved Caspase-3蛋白水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。详见图3、表3。

图3 各组骨关节炎软骨细胞中Caspase-3蛋白的表达

表3 各组骨关节炎软骨细胞中Caspase-3蛋白表达的比较

2.3 依托考昔对骨关节炎软骨细胞中炎性因子表达的影响与对照组比较，依托考昔低剂量组、依托考昔中剂量组、依托考昔高剂量组TNF-α、IL-1β的水平显著降低(P<0.05)，且依托考昔低剂量组、依托考昔中剂量组、依托考昔高剂量组TNF-α、IL-1β的水平比较，差异有统计学意义(P<0.05，图4)。

注：与对照组比较，*P<0.05；与依托考昔低剂量组比较，#P<0.05；与依托考昔中剂量组比较，△P<0.05。图4 各组骨关节炎软骨细胞中炎性因子表达水平的比较

2.4 依托考昔对骨关节炎软骨细胞SDF-1/CXCR4的影响与对照组比较，依托考昔低剂量组、依托考昔中剂量组、依托考昔高剂量组SDF-1、CXCR4 mRNA的表达水平显著降低(P<0.05)，且依托考昔低剂量组、依托考昔中剂量组、依托考昔高剂量组SDF-1、CXCR4 mRNA的表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05，表4)。

表4 各组骨关节炎软骨细胞中SDF-1、CXCR4 mRNA表达的比较

3 讨论

近年来，骨关节炎发病率逐年上升，已严重影响患者的生活质量。既往研究显示，天然药物、非甾体类抗炎药等可用于骨关节炎的治疗，但部分抗炎药会对人体消化系统、神经系统等造成一定损害[9-10]。目前，关于依托考昔治疗骨关节炎的作用机制尚未阐明，因而本研究主要探讨依托考昔在骨关节炎治疗过程中的作用机制。

依托考昔是一种临床常用的高效抗炎药物，具有抗炎、抗氧化等作用。研究发现，依托考昔治疗关节炎具有副作用少、疗效好等优点[11-13]，但其作用机制尚未完全阐明。本研究分离培养人骨关节炎软骨细胞，使用不同浓度的依托考昔处理后，细胞存活率显著升高，细胞凋亡率显著降低，且呈现剂量依赖性。这提示，依托考昔可抑制骨关节炎软骨细胞凋亡，促进细胞增殖。研究发现，Caspase是细胞凋亡的主要通路，Caspase-3是细胞凋亡反应中重要的调节因子，线粒体损伤后可促进细胞色素C释放至细胞质而激活Caspase-3级联反应，从而促进细胞凋亡[14]。本研究结果显示，用依托考昔处理后pro-Caspase-3蛋白水平显著升高，cleaved Caspase-3蛋白水平显著降低，且呈现剂量依赖性。这提示，依托考昔可能通过调控线粒体途径抑制骨关节炎软骨细胞凋亡。软骨细胞损伤后巨噬细胞释放TNF-α、IL-1β等炎性因子，参与软骨退变过程，TNF-α、IL-1β相互作用可加重滑膜炎症及关节软骨的退变程度，还可抑制软骨细胞增殖[15]。本研究结果显示，用依托考昔处理后TNF-α、IL-1β的水平显著降低，并呈现剂量依赖性。这提示，依托考昔可减轻骨关节炎软骨细胞的炎症损伤。

SDF-1/CXCR4信号通路属于炎症反应偶联分子对，SDF-1可与其受体CXCR4相互作用参与骨关节炎等炎症反应的发生及发展过程，抑制SDF-1/CXCR4信号通路的活化可降低炎症反应[9，16-17]。本研究结果显示，依托考昔可抑制SDF-1、CXCR4的表达，且随着药物使用剂量的增加其抑制作用显著增强。这提示，依托考昔可能通过抑制SDF-1/CXCR4信号通路减轻骨关节炎软骨细胞的损伤。

综上所述，依托考昔可能通过抑制SDF-1/CXCR4信号通路促进骨关节炎软骨细胞增殖、抑制细胞凋亡及减少炎症反应，但关于其具体作用机制仍需进一步探讨。