姜黄素可缓解多囊卵巢综合征大鼠卵巢炎症状态并改善其功能

张韵函，谢盛言，何珊珊

(遵义医科大学附属第三医院，遵义市第一人民医院 妇产科，遵义 563000)

多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一种常见的内分泌疾病，患者可出现多种代谢紊乱症状，如胰岛素抵抗、胰岛β细胞功能障碍、葡萄糖不耐受、血脂异常和肥胖等[1-2]。患者内分泌激素如卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)、雌二醇(estradiol，E2)、黄体生成素(luteinizing hormone，LH)、孕酮(progesterone，P)、睾酮(testosterone，T)的分泌紊乱，可能与受精率降低及胚胎发育异常有关[3]。许多研究证实，在PCOS患者中，CRP与胰岛素抵抗、体质量和脂肪含量呈正相关。此外，IL-6在卵巢成熟和胚胎着床过程中发挥重要作用[4]。TNF-α是一种能够刺激卵泡膜细胞增殖的炎性因子，在卵泡和黄体期对卵巢的正常活动起重要调节作用，可在巨噬细胞、卵母细胞、颗粒细胞、闭锁卵巢和卵泡膜细胞中检测到其基因表达[5]。

姜黄是一种生长在东南亚热带地区的植物，姜黄素是一种提取自姜黄根茎的黄色多酚类化合物[6]。近期的研究结果表明，姜黄素具有强大的抗炎活性，能够降低TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子水平，在多种炎症相关性疾病中均有良好效果[7]。鉴于以上因素，研究比较姜黄素对PCOS大鼠模型血清性激素(E2、LH、FSH、P、T)及组织中TNF-α、IL-6和CRP水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物随机取70只3周龄雌性SD大鼠，于SPF条件下给予12 h/12 h昼夜交替环境。室温控制在(25±1) ℃，于实验前1周对大鼠进行适应性饲养，每天定时供应食物和水。

1.2 实验方法

1.2.1 造模及样本的制备 将70只雌性SD大鼠随机分为正常组(N组)(10只)及PCOS造模组(60只)。模型组于皮下注射60 mg/kg的5%脱氢表雄酮，连续注射20 d。第21天起自模型组和正常组中各随机抽取5只大鼠行阴道涂片，观察动情周期变化，连续观察3个动情周期(约15 d)，于造模以及药物干预期间每日用电子天平称量大鼠体质量。于第15天自大鼠球后静脉丛取血、离心、分离血清，采用放射免疫法检测血清性激素水平及空腹血清胰岛素(fasting serum insulin，FINS)。显微镜下观察并判断动情状态：动情前期的涂片出现有核上皮细胞，偶有少量角化细胞；动情期涂片则显示无核角化细胞或偶有少量上皮细胞；动情后期出现有核上皮细胞、无核上皮细胞和白细胞；动情间期的涂片中存在大量白细胞，当大鼠阴道涂片连续出现角化细胞、动情周期和性激素水平紊乱及FINS水平升高提示造模成功。随后将造模组大鼠根据动情周期结果分为4组， 即PCOS模型组(PCOS组)、药物治疗高剂量组(A组)、中剂量组(B组)及低剂量组(C组)，随后进行为期一个月的腹腔姜黄素注射治疗(高剂量组100 mg/ kg、中剂量组75mg/ kg、低剂量组50 mg/ kg)，正常组和对照组均注射等量生理盐水。姜黄素连续治疗30 d后，麻醉各组大鼠并自腹主动脉处采血，离心取上清液备用；处死大鼠取双侧卵巢，剥除多余脂肪组织并用电子天平称重，计算卵巢指数[大鼠卵巢指数=(大鼠卵巢湿重/大鼠体质量)× 100%]；取一侧大鼠卵巢石蜡包埋以行免疫组化检测，另一侧用锡纸包埋后迅速放入液氮中保存。

1.2.2 ELISA检测各组大鼠血清性激素水平 按照ELISA检测试剂盒说明书测定大鼠血清中性激素水平(E2、LH、FSH、P、T)，于酶标仪测定光密度D(450 nm)。

1.2.3 免疫组织化学法染色 切片脱蜡，抗原修复后加入稀释好的抗TNF-α、IL-6抗体(稀释度为TNF-α 1∶100，IL-6 1∶200)，加入适量生物素标记的二抗工作液，显色剂显色，流水充分漂洗，复染，脱水，透明，封片。显微镜下染色结果示卵巢组织样本中细胞胞质呈淡黄色或黄色颗粒状着色，采用IPP 6.0软件于相同条件下检测每张组织切片中TNF-α、IL-6表达的积分光密度(integrated optical density， IOD)。

1.2.4 ELISA检测各组大鼠血清CRP、IL-6、TNF-α水平 按照ELISA检测试剂盒说明书测定大鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α水平，于酶标仪测定光密度[D(450 nm)]值。

1.2.5 血糖检测仪检测各组大鼠血清空腹血糖(fasting blood glucose， FBG)、FINS和稳态模型胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment-insulin resistance index，HOMA-IR)水平 用血糖检测仪检测各组大鼠血清FBG、FINS和HOMA-IR水平。

2 结果

2.1 大鼠动情周期的测量与N组相比，PCOS组大鼠动情周期不规律且出现紊乱，其中动情前期、动情期持续时间差异无统计学意义(P>0.05)，但动情间期及后期显著延长 (P<0.05)，经过药物治疗动情周期紊乱及延长的情况得到有效改善。详见表1。

表1 各组大鼠动情周期变化情况

2.2 各组大鼠血清E2、LH、FSH、P、T水平及卵巢指数和大鼠体质量的检测结果显示，PCOS组与N组比较，大鼠血清FSH、P水平显著降低(P<0.05)，E2、LH、T水平显著升高，大鼠体质量和卵巢指数也显著升高(P<0.05)；药物处理后，各治疗组与PCOS组比较，血清FSH、P水平显著升高，E2、LH、T水平显著降低，大鼠体质量和卵巢指数也显著降低(均P<0.05，表2、表3)。

表2 各组大鼠血清性激素水平比较

表3 各组大鼠卵巢指数及体质量比较

2.3 各组大鼠血清FBG、FINS和HOMA-IR水平的检测PCOS组大鼠血清中FBG、FINS及HOMA-IR水平较N组显著升高(P<0.05)；各药物治疗组大鼠血清FBG、FINS及HOMA-IR水平与PCOS组相比下降，其中高、中剂量治疗组水平下降显著(P<0.05，表4)。

表4 各组大鼠血清FBG、FINS及HOMA-IR水平比较

2.4 各组大鼠血清CRP、IL-6和TNF-α水平的检测与N组相比，PCOS组血清CRP、IL-6和TNF-α水平显著升高，药物干预后各治疗组血清CRP、IL-6、TNF-α与PCOS组相比均下降，其中高、中剂量治疗组下降显著(均P<0.05，表5)。

表5 各组大鼠血清CRP、IL-6和TNF-α水平比较

2.5 TNF-α在卵巢组织中的表达结果显示，TNF-α蛋白在卵巢颗粒细胞、卵母细胞及颗粒黄体细胞中表达。与PCOS组相比，N组和药物干预组TNF-α在卵泡颗粒层的表达很少且在卵泡膜中不表达，但在卵泡液中有明显的沉淀(棕色)。与PCOS组相比，药物治疗组卵巢、卵巢颗粒细胞和卵母细胞周围TNF-α表达减少，其中高剂量药物治疗组效果最佳(P<0.05)，卵巢中TNF-α表达量显著下降。详见图1、表6。

注：A.N组；B.POCS组；C.A组；D.B组；E.C组。图1 免疫组织化学染色分析各组大鼠卵巢组织中TNF-α的表达(×200)

表6 各组大鼠卵巢组织中TNF-α表达水平的比较

2.6 IL-6在卵巢组织中的表达结果显示，与N组比较，PCOS组卵巢间质、腔前卵泡和颗粒层中IL-6表达显著增加(P<0.05)；药物治疗后各组间质细胞、卵泡膜、颗粒卵泡中IL-6的表达较PCOS模型组显著降低(P<0.01)，其中高剂量药物治疗组作用最佳，卵巢中IL-6表达量显著下降(P<0.05)。详见图2、表7。

表7 各组大鼠卵巢组织中IL-6表达水平的比较

注：A.N组；B.POCS组；C.A组；D.B组；E.C组。图2 免疫组织化学染色分析各组大鼠卵巢组织中IL-6的表达(×200)

3 讨论

PCOS患者治疗的总体目标是帮助妇女正常排卵，降低雄激素水平、体质量及糖尿病和心血管疾病风险[8]。一般来说，大多数PCOS患者卵巢内有多个小卵泡，这些卵泡通常对促性腺激素敏感。Van H等[9]的研究提示PCOS患者卵巢和内脏脂肪厚度增加。本研究PCOS模型组大鼠体质量增加，动情周期出现紊乱及延长现象，卵巢指数上升，说明建模成功。Smith等[10]的研究提示PCOS患者卵泡颗粒细胞可能存在异常，内脏脂肪量的增加导致血清TNF-α水平上升。Eleni等[11]报道称PCOS患者血清TNF-α水平升高，可能是IL-6刺激单核细胞产生的，为探讨IL-6、高雄激素血症与人体代谢改变的关系，进一步了解PCOS相关内分泌代谢异常的意义，本研究测定了PCOS大鼠性激素水平、代谢相关指标及慢性炎症指标IL-6、TNF-α和CRP的水平。

黄红艺等[12]研究表明，CRP水平升高与胰岛素抵抗有关，增加了2型糖尿病及心血管疾病的发病风险。Ramezani等[13]的研究表明，PCOS患者血清中CRP水平升高，提示患者体内存在慢性炎症，他们还发现PCOS患者CRP水平升高与肥胖有关。Cabus U等[14]2020年的研究结果显示，CRP水平的降低与接受二甲双胍治疗的PCOS患者代谢症状的减轻是一致的。姜黄素的治疗与降低CRP水平有关，这些发现符合姜黄素对该综合征的治疗作用。有研究表明，PCOS患者血清炎性因子(IL-6和IL-18)水平显著升高，与胰岛素敏感性参数呈正相关；姜黄素调节机体代谢以及内分泌功能，有助于改善PCOS症状[15]。体外研究表明，炎性因子能够上调卵巢卵泡膜细胞中的类固醇生成酶水平，炎性因子也能刺激卵泡膜细胞的增殖。此外，异常的炎症反应可能会损害排卵过程的精细调节。2009年，Maryam T等[16-17]研究显示姜黄素处理对卵巢癌细胞起到抗增殖、促凋亡和激素分泌抑制等作用。这些作用不仅在小鼠在体与离体卵巢细胞中可观察到，也可在人卵巢细胞中观察到。脂肪组织源性细胞因子(TNF-α、IL-6)的表达可能是维持慢性炎症的重要因素，内脏脂肪组织的堆积可能是支持代谢综合征和慢性炎症反应的关键因素。Hu X等[18]的研究结果提示，姜黄素抑制卵巢癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，减少激素的产生和释放，因此，他们建议将姜黄素作为新的治疗方法。Wang C等[19]发现姜黄素可能通过抑制胰蛋白酶的活性和NF-κB信号通路中细胞的凋亡以减少卵巢组织损伤。本研究发现，姜黄素治疗能降低卵巢指数减少原始卵泡和黄体数量，并在治疗后改善动情周期及性激素水平的紊乱，调节血糖，降低炎性因子在血清及组织中的表达，可能成为临床治疗PCOS的一种新方法。