EB病毒阳性的不同类型淋巴瘤组织中EBNA1多态性研究*

徐海芹， 冯征远， 徐晓艳 ， 孙亮亮

（1内蒙古医学院附属医院病理科，内蒙古呼和浩特010059；2内蒙古自治区人民医院医学检验科，内蒙古呼和浩特010010；3内蒙古自治区第四医院检验科，内蒙古呼和浩特010010）

近年来大量研究发现EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）在伯基特淋巴瘤、弥漫大B 细胞淋巴瘤、经典型霍奇金淋巴瘤及NK/T 细胞淋巴瘤中的检出率显著高于其他肿瘤，推测其可能在肿瘤发病过程中起到重要作用［1］。而Southern印迹（Southern blot）、多聚酶链式反应（PCR）、免疫组织化学染色（IHC）和原位杂交（ISH）等技术的运用，进一步推动了对EBV致瘤性基因表达及其致瘤机制的深入研究。

EBV 是一种线性双链DNA 病毒，广泛存在于人类中的嗜B 淋巴细胞，在全世界人群中感染非常普遍［2］。大量研究报道EBV 相关的肿瘤呈人种和地域分布性，其原因可能与遗传、环境和／或病毒因素有关。由于不同来源的EBV毒株存在基因变异和生物学功能的差异，因此是否存在高致病EBV 变异毒株一直倍受关注。本实验主要通过观察15 例EBV 阳性的不同类型淋巴瘤病例中EBV 核抗原1（EBV nuclear antigen 1，EBNA1）羧基端的变异情况，探讨本地区EB 病毒与不同淋巴瘤之间的关系，以及观察是否存在与其他地区不同的EBNA1羧基端变异情况。

材料和方法

1 一般资料

选内蒙古医科大学附属医院病理科2009 年1 月至2013 年1 月间淋巴瘤标本共15 例，年龄在12～81岁之间，男11例，女4例。所有病例均经两位以上病理专家复查后确诊。

2 方法

采用酚、氯仿-异戊醇法常规提取EBV 阳性细胞系 B95-8 和 EBV 阴性细胞系 Ramos 细胞 DNA，使用TIANamp FFPE DNA Kit 石蜡包埋组织DNA 提取试剂盒（离心柱型）提取石蜡包埋组织DNA，实验步骤按照说明书进行，试剂购自天根生化科技（北京）有限公司。依据B95-8 序列（基因序列号：V01555.1），应用Primerpremier 5 软件设计扩增EBNA1基因的引物，采用巢式PCR 方法进行扩增，试剂购自天根生化科技（北京）有限公司。采用琼脂糖凝胶电泳方法检验PCR 扩增是否成功，试剂购自上海玉博生物科技有限公司。基因测序送北京华大基因有限公司

结 果

1 聚合酶链式反应（PCR）和凝胶电泳结果

用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）方法对EBV 阳性的淋巴瘤病例进行EBNA1基因羧基端的扩增，成功扩增15 例，并将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。实验结果见图1。15 例中，其中经典型霍奇金淋巴瘤7 例、弥漫性大B 细胞淋巴瘤3 例、NK/T 细胞淋巴瘤3 例、滤泡性淋巴瘤1例和T 淋巴母细胞性淋巴瘤1 例。PCR 扩增结果与EBER 阳性结果比较发现，PCR 1、3和13号样本扩增产物较少，其相应的EBER 表达为散在分布，小细胞（非肿瘤细胞）阳性，2～3 个/HPF，两种检测结果一致；PCR 2和4号样本扩增产物较少，EBER 的表达为弥漫分布，大细胞（肿瘤细胞）阳，100个/HPF，两种检测结果不一致，可能是由于样本保存问题，导致EBNA1 羧基端部分断裂所致；PCR 5、6、8～12和15号样本扩增产物较多，其相应的EBER 表达为弥漫分布，大细胞（肿瘤细胞）阳，100 个/HPF，两种检测结果一致；PCR 7号样本为滤泡性淋巴瘤，扩增产物较多，其相应的EBER 表达为散在分布，小、中、大细胞（非肿瘤细胞）阳，10～15 个/HPF，EBER 阳性细胞数相对较多，因此认为两种检测结果一致；PCR 14号样本为淋巴细胞为主型的经典型霍奇金淋巴瘤，扩增产物较少，其相应的EBER 表达为散在分布，大细胞（肿瘤细胞）阳，阳性的肿瘤细胞数整体看并不多，因此两种检测结果一致。综上所述，EBNA1基因羧基端的PCR 扩增产物与EBER 表达情况基本一致，说明EBER 的表达常伴随EBNA1 的表达。PCR 扩增产物较多的病例主要为弥漫性大B 细胞淋巴瘤、NK/T 细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤，由此说明EBV 感染在不同类型淋巴瘤中的表达主要与弥漫大B 细胞淋巴瘤、NK/T 细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤的发病有关，这与其他地区的研究结果一致。

2 上述淋巴瘤（图1）EBNA1 基因羧基端突变热点AA487及AA466-527之间的变异情况

Figure 1. The expression of carboxyl terminal of EBNA1 gene in 15 cases of lymphoma.图1 15例淋巴瘤中EBNA1基因羧基端的表达情况

本实验对有EBER 阳性细胞（包括肿瘤细胞和非肿瘤细胞）的淋巴瘤病例进行EBNA1 基因羧基端的扩增，成功扩增15 例，并将扩增产物送至华大基因进行测序分析。测序结果显示（表1），其编码产物为AA439-555，该段序列包含了以往研究中发现的突变热点AA487 及AA466-527 之间的变异。与标准株B95-8相比，15例EBV 阳性淋巴瘤组织标本中EBNA1 羧基端均出现序列变异。1号（T）、2号（NK/T）、3 号（NK/T）、4 号（HL）、8 号（HL）、9 号（HL）、11 号（DL）、13 号（DL）、14 号（HL）和15 号（HL）样本出现了错义突变AA487 A→V、499 D→E、502 T→N、524 T→I、528 I→V 和 533 L→I，无义突变为 AA 520 密码子cat→ctc，与以往研究此段基因变异情况一致；5号（HL）样本除了出现了共有突变：错义突变487 A→V（图 2）、499 D→E、02 T→N、524 T→I、528 I→V 和533 L→I，无义突变为 AA 520 密码子 cat→ctc 外，还出现了错义突变AA462 G→E、466 G→R和无义突变AA466 密码子 gga→gaa；这与以往研究不同；6 号（DL）、7 号（FL）样本除了出现了共有突变：错义突变487 A→V、499 D→E、502 T→N、524 T→I、528 I→V和 533 L→I，无义突变为 AA 520 密码子 cat→ctc 外，还出现了无义突变为AA 480 密码子aac→atc 和AA 547 密码子ccc→cct 突变，这与以往的研究不同；10号（NK/T）样本只出现了499 D→E，这与以往的研究不同；12 号（HL）样本出现了与共有突变不同的错义突变AA 487 A→L、492 S→C、502 T→N 和524 T→I。综上所述，1 号、3 号和 13 号样本 EBER 阳性细胞为非肿瘤细胞，但是也均出现了共有突变，由此推测，这些EBNA1 羧基端突变是否诱发非肿瘤细胞释放了肿瘤发生因子，从而促进淋巴瘤的发生，或者这几例淋巴瘤的发生与EBV 无关，EBV 感染只是一种潜伏状态，而是通过其他途径导致了肿瘤的发生，又或者EBNA1 基因的变异与疾病无关，只与地区限制性有关，这有待于进一步研究。7 号样本EBER 阳性细胞为非肿瘤细胞，除了出现共有突变外，还出现了非共有突变，这与此样本EBER 阳性细胞数较多并且EBNA1 扩增产物也较多是否有关，有待于进一步研究。5 号、6 号、10 号和 12 号样本 EBER 阳性细胞为肿瘤细胞，除了有部分共有突变外，均出现了非共有突变，这些突变可能是偶然事件，但也不能除外与肿瘤的发生有关或是由于地域差异导致，有待于进一步研究。

表1 15例淋巴瘤的EBNA1羧基末端基因变异情况Table 1. Variation of EBNA1 carboxyl terminal gene in 15 cases of lymphoma

讨 论

近年来EBV是研究较多的与肿瘤密切相关的一种致肿瘤生物因素。EBV 基因组至少有85 个可编码基因，这些基因可在EBV 感染的潜伏阶段或裂解阶段表达。因为EBV潜伏感染和细胞转化能力是其致癌的基础，所以目前测序分析主要是针对EBV 潜伏期基因。潜伏期表达的基因主要包括2 种EBV 编码小 RNA（EBV-encoded small RNAs，EBERl 和 EBER2）；6种核抗原（EBV nuclear antigen，EBNA）家族，包括 EBNAl、2、3A、3B、3C 和主导蛋白（1eader protein，EBNA-LP）；潜伏膜蛋白（1atent membrane protein，LMP1）1、2A 和 2B 以及 BamHI-A 右向转录产物（BamHI-A rightward transcripts，BARTs）［3］。 在裂解性感染时，大量的病毒结构基因和调节基因表达，包括即刻早期基因、早期基因和晚期基因［4-5］。

目前已知EBV多种潜伏期基因编码产物可引起细胞转化，其中核抗原家族基因（EBNAs）编码产物中的EBNA1 是唯一在所有EBV 相关肿瘤中均表达的蛋白，近年来研究表明，不同的肿瘤又表现不同的潜伏模式，I 型潜伏感染的有胃癌及Burkitt 淋巴瘤，表达EBER和EBNA1；II型潜伏感染的有霍奇金淋巴瘤HL、鼻咽癌及NK/T 细胞淋巴瘤，表达LMP1、LMP2A、LMP2B、EBNA1 和 EBER；III 型潜伏感染主要见于弥漫性大B 细胞淋巴瘤（DCBCL）及免疫抑制患者的淋巴组织增生性疾病，病毒表达所有的EBNAs、LMPs、EBERs 和 BARTs；IV 型潜伏感染仅发生在健康病毒携带者的B 细胞淋巴细胞中，病毒表达LMP2A、EBERs 和BARTs。由此可见除了健康病毒携带者外，其他EBV 阳性的肿瘤性患者中均可检测到EBNA1和EBER基因。由于原位杂交的方法（检测EBER）不需要昂贵的仪器，操作较简单、不易污染，因此目前临床病理诊断中常规是用原位杂交的方法检测EBV。本研究采用PCR 方法检测EBNA1，虽然检测结果与原位杂交一致，但是PCR 产物可以进一步研究EBNA1基因多态性，而且PCR 方法灵敏度高，更易检出阳性结果。当病毒潜伏感染时，其在基因组的维持、复制和转录过程中发挥重要作用［6］。EBNA1 重复序列可通过顺式作用方式抑制抗原递呈细胞对自身的加工处理，使CTL 不能识别自身免疫表位从而逃避机体免疫应答［7］。EBNA1 由N 端（AA1-89）、甘氨酸和丙氨酸重复序列（AA 90-327）以及C端（AA328-641）组成，对EBNA1基因变异的分析多集中在 C 端［8-9］。因此，本研究对 EBV 阳性淋巴瘤组织中EBNA1编码基因C端的多态性进行了检测和分析，旨在探讨EBNA1 多态性在EBV 阳性淋巴瘤发生中的意义。

本实验采用PCR 方法对有EBER 阳性细胞（包括肿瘤细胞和非肿瘤细胞）的淋巴瘤病例进行EBNA1基因羧基端的扩增，成功扩增15例，并将扩增产物进行凝胶电泳分析。实验结果显示，EBNA1基因羧基端的PCR 扩增产物与EBER 表达情况基本一致，PCR 扩增产物较多的病例主要为弥漫性大B 细胞淋巴瘤、NK/T 细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤，由此说明EBV感染在不同类型淋巴瘤中的表达主要与弥漫大B 细胞淋巴瘤、NK/T 细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤有关，这与其他地区的研究结果一致；同时也说明EBER 与EBNA1 常常伴随表达。PCR 扩增产物较少的几乎是伴有EBV 潜伏感染的淋巴瘤病例，EBV 在这些淋巴瘤中可能只属于伴随情况，为非致瘤性。

Figure 2. Mutation of aa487 at C-terminal of EBNA1 gene in some lymphomas. A：negative control（wild type）；B：mutation of aa487 at the carboxyl end of EBNA1 gene in sample 5 of classical Hodgkin′s lymphoma（GCT→GTT，that was A→V）.图2 部分淋巴瘤中EBNA1基因C端AA487位点的突变情况

将扩增产物送至华大基因进行测序分析，测序结果显示，其编码产物为AA439-555，该段序列包含了以往研究中发现的突变热点AA487 及AA466-527之间的变异。与标准株B95-8 相比，15 例EBV 阳性淋巴瘤组织标本中EBNA1 羧基端均出现序列变异。几例非肿瘤细胞EBER阳性的淋巴瘤，也均出现了与以往研究相同的共有突变［10］，由此推测，这些EBNA1羧基端突变是否诱发非肿瘤细胞释放了肿瘤发生因子，从而促进淋巴瘤的发生，或者这几例淋巴瘤的发生与EBV无关，EBV感染只是一种潜伏状态，而是通过其他途径导致了肿瘤的发生，这有待于进一步研究。而肿瘤细胞EBER 阳性的淋巴瘤样本中除了有部分共有突变外，均出现了非共有突变，这些突变可能是偶然事件，也可能由于地域差异导致，或是某种类型淋巴瘤的致瘤原因，有待于进一步深入研究。

综上所述，EBV 基因组结构复杂，表达的蛋白及基因产物较多。其与多数肿瘤发生、发展密切相关，目前针对淋巴瘤的研究较多。本实验研究发现，该地区淋巴瘤病例中EBNA1 羧基端变异类型与其他地区除了有部分共有突变外，均出现了非共有突变，这些突变可能是偶然事件，也不可能除外与肿瘤的发生有关或由于地域差异导致，为探索EBV 的致病机制提供了一定价值。