徐海芹, 冯征远, 徐晓艳 , 孙亮亮
(1内蒙古医学院附属医院病理科,内蒙古呼和浩特010059;2内蒙古自治区人民医院医学检验科,内蒙古呼和浩特010010;3内蒙古自治区第四医院检验科,内蒙古呼和浩特010010)
近年来大量研究发现EB 病毒(Epstein-Barr virus,EBV)在伯基特淋巴瘤、弥漫大B 细胞淋巴瘤、经典型霍奇金淋巴瘤及NK/T 细胞淋巴瘤中的检出率显著高于其他肿瘤,推测其可能在肿瘤发病过程中起到重要作用[1]。而Southern印迹(Southern blot)、多聚酶链式反应(PCR)、免疫组织化学染色(IHC)和原位杂交(ISH)等技术的运用,进一步推动了对EBV致瘤性基因表达及其致瘤机制的深入研究。
EBV 是一种线性双链DNA 病毒,广泛存在于人类中的嗜B 淋巴细胞,在全世界人群中感染非常普遍[2]。大量研究报道EBV 相关的肿瘤呈人种和地域分布性,其原因可能与遗传、环境和/或病毒因素有关。由于不同来源的EBV毒株存在基因变异和生物学功能的差异,因此是否存在高致病EBV 变异毒株一直倍受关注。本实验主要通过观察15 例EBV 阳性的不同类型淋巴瘤病例中EBV 核抗原1(EBV nuclear antigen 1,EBNA1)羧基端的变异情况,探讨本地区EB 病毒与不同淋巴瘤之间的关系,以及观察是否存在与其他地区不同的EBNA1羧基端变异情况。
选内蒙古医科大学附属医院病理科2009 年1 月至2013 年1 月间淋巴瘤标本共15 例,年龄在12~81岁之间,男11例,女4例。所有病例均经两位以上病理专家复查后确诊。
采用酚、氯仿-异戊醇法常规提取EBV 阳性细胞系 B95-8 和 EBV 阴性细胞系 Ramos 细胞 DNA,使用TIANamp FFPE DNA Kit 石蜡包埋组织DNA 提取试剂盒(离心柱型)提取石蜡包埋组织DNA,实验步骤按照说明书进行,试剂购自天根生化科技(北京)有限公司。依据B95-8 序列(基因序列号:V01555.1),应用Primerpremier 5 软件设计扩增EBNA1基因的引物,采用巢式PCR 方法进行扩增,试剂购自天根生化科技(北京)有限公司。采用琼脂糖凝胶电泳方法检验PCR 扩增是否成功,试剂购自上海玉博生物科技有限公司。基因测序送北京华大基因有限公司
用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法对EBV 阳性的淋巴瘤病例进行EBNA1基因羧基端的扩增,成功扩增15 例,并将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。实验结果见图1。15 例中,其中经典型霍奇金淋巴瘤7 例、弥漫性大B 细胞淋巴瘤3 例、NK/T 细胞淋巴瘤3 例、滤泡性淋巴瘤1例和T 淋巴母细胞性淋巴瘤1 例。PCR 扩增结果与EBER 阳性结果比较发现,PCR 1、3和13号样本扩增产物较少,其相应的EBER 表达为散在分布,小细胞(非肿瘤细胞)阳性,2~3 个/HPF,两种检测结果一致;PCR 2和4号样本扩增产物较少,EBER 的表达为弥漫分布,大细胞(肿瘤细胞)阳,100个/HPF,两种检测结果不一致,可能是由于样本保存问题,导致EBNA1 羧基端部分断裂所致;PCR 5、6、8~12和15号样本扩增产物较多,其相应的EBER 表达为弥漫分布,大细胞(肿瘤细胞)阳,100 个/HPF,两种检测结果一致;PCR 7号样本为滤泡性淋巴瘤,扩增产物较多,其相应的EBER 表达为散在分布,小、中、大细胞(非肿瘤细胞)阳,10~15 个/HPF,EBER 阳性细胞数相对较多,因此认为两种检测结果一致;PCR 14号样本为淋巴细胞为主型的经典型霍奇金淋巴瘤,扩增产物较少,其相应的EBER 表达为散在分布,大细胞(肿瘤细胞)阳,阳性的肿瘤细胞数整体看并不多,因此两种检测结果一致。综上所述,EBNA1基因羧基端的PCR 扩增产物与EBER 表达情况基本一致,说明EBER 的表达常伴随EBNA1 的表达。PCR 扩增产物较多的病例主要为弥漫性大B 细胞淋巴瘤、NK/T 细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤,由此说明EBV 感染在不同类型淋巴瘤中的表达主要与弥漫大B 细胞淋巴瘤、NK/T 细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤的发病有关,这与其他地区的研究结果一致。
Figure 1. The expression of carboxyl terminal of EBNA1 gene in 15 cases of lymphoma.图1 15例淋巴瘤中EBNA1基因羧基端的表达情况
本实验对有EBER 阳性细胞(包括肿瘤细胞和非肿瘤细胞)的淋巴瘤病例进行EBNA1 基因羧基端的扩增,成功扩增15 例,并将扩增产物送至华大基因进行测序分析。测序结果显示(表1),其编码产物为AA439-555,该段序列包含了以往研究中发现的突变热点AA487 及AA466-527 之间的变异。与标准株B95-8相比,15例EBV 阳性淋巴瘤组织标本中EBNA1 羧基端均出现序列变异。1号(T)、2号(NK/T)、3 号(NK/T)、4 号(HL)、8 号(HL)、9 号(HL)、11 号(DL)、13 号(DL)、14 号(HL)和15 号(HL)样本出现了错义突变AA487 A→V、499 D→E、502 T→N、524 T→I、528 I→V 和 533 L→I,无义突变为 AA 520 密码子cat→ctc,与以往研究此段基因变异情况一致;5号(HL)样本除了出现了共有突变:错义突变487 A→V(图 2)、499 D→E、02 T→N、524 T→I、528 I→V 和533 L→I,无义突变为 AA 520 密码子 cat→ctc 外,还出现了错义突变AA462 G→E、466 G→R和无义突变AA466 密码子 gga→gaa;这与以往研究不同;6 号(DL)、7 号(FL)样本除了出现了共有突变:错义突变487 A→V、499 D→E、502 T→N、524 T→I、528 I→V和 533 L→I,无义突变为 AA 520 密码子 cat→ctc 外,还出现了无义突变为AA 480 密码子aac→atc 和AA 547 密码子ccc→cct 突变,这与以往的研究不同;10号(NK/T)样本只出现了499 D→E,这与以往的研究不同;12 号(HL)样本出现了与共有突变不同的错义突变AA 487 A→L、492 S→C、502 T→N 和524 T→I。综上所述,1 号、3 号和 13 号样本 EBER 阳性细胞为非肿瘤细胞,但是也均出现了共有突变,由此推测,这些EBNA1 羧基端突变是否诱发非肿瘤细胞释放了肿瘤发生因子,从而促进淋巴瘤的发生,或者这几例淋巴瘤的发生与EBV 无关,EBV 感染只是一种潜伏状态,而是通过其他途径导致了肿瘤的发生,又或者EBNA1 基因的变异与疾病无关,只与地区限制性有关,这有待于进一步研究。7 号样本EBER 阳性细胞为非肿瘤细胞,除了出现共有突变外,还出现了非共有突变,这与此样本EBER 阳性细胞数较多并且EBNA1 扩增产物也较多是否有关,有待于进一步研究。5 号、6 号、10 号和 12 号样本 EBER 阳性细胞为肿瘤细胞,除了有部分共有突变外,均出现了非共有突变,这些突变可能是偶然事件,但也不能除外与肿瘤的发生有关或是由于地域差异导致,有待于进一步研究。
表1 15例淋巴瘤的EBNA1羧基末端基因变异情况Table 1. Variation of EBNA1 carboxyl terminal gene in 15 cases of lymphoma
近年来EBV是研究较多的与肿瘤密切相关的一种致肿瘤生物因素。EBV 基因组至少有85 个可编码基因,这些基因可在EBV 感染的潜伏阶段或裂解阶段表达。因为EBV潜伏感染和细胞转化能力是其致癌的基础,所以目前测序分析主要是针对EBV 潜伏期基因。潜伏期表达的基因主要包括2 种EBV 编码小 RNA(EBV-encoded small RNAs,EBERl 和 EBER2);6种核抗原(EBV nuclear antigen,EBNA)家族,包括 EBNAl、2、3A、3B、3C 和主导蛋白(1eader protein,EBNA-LP);潜伏膜蛋白(1atent membrane protein,LMP1)1、2A 和 2B 以及 BamHI-A 右向转录产物(BamHI-A rightward transcripts,BARTs)[3]。 在裂解性感染时,大量的病毒结构基因和调节基因表达,包括即刻早期基因、早期基因和晚期基因[4-5]。
目前已知EBV多种潜伏期基因编码产物可引起细胞转化,其中核抗原家族基因(EBNAs)编码产物中的EBNA1 是唯一在所有EBV 相关肿瘤中均表达的蛋白,近年来研究表明,不同的肿瘤又表现不同的潜伏模式,I 型潜伏感染的有胃癌及Burkitt 淋巴瘤,表达EBER和EBNA1;II型潜伏感染的有霍奇金淋巴瘤HL、鼻咽癌及NK/T 细胞淋巴瘤,表达LMP1、LMP2A、LMP2B、EBNA1 和 EBER;III 型潜伏感染主要见于弥漫性大B 细胞淋巴瘤(DCBCL)及免疫抑制患者的淋巴组织增生性疾病,病毒表达所有的EBNAs、LMPs、EBERs 和 BARTs;IV 型潜伏感染仅发生在健康病毒携带者的B 细胞淋巴细胞中,病毒表达LMP2A、EBERs 和BARTs。由此可见除了健康病毒携带者外,其他EBV 阳性的肿瘤性患者中均可检测到EBNA1和EBER基因。由于原位杂交的方法(检测EBER)不需要昂贵的仪器,操作较简单、不易污染,因此目前临床病理诊断中常规是用原位杂交的方法检测EBV。本研究采用PCR 方法检测EBNA1,虽然检测结果与原位杂交一致,但是PCR 产物可以进一步研究EBNA1基因多态性,而且PCR 方法灵敏度高,更易检出阳性结果。当病毒潜伏感染时,其在基因组的维持、复制和转录过程中发挥重要作用[6]。EBNA1 重复序列可通过顺式作用方式抑制抗原递呈细胞对自身的加工处理,使CTL 不能识别自身免疫表位从而逃避机体免疫应答[7]。EBNA1 由N 端(AA1-89)、甘氨酸和丙氨酸重复序列(AA 90-327)以及C端(AA328-641)组成,对EBNA1基因变异的分析多集中在 C 端[8-9]。因此,本研究对 EBV 阳性淋巴瘤组织中EBNA1编码基因C端的多态性进行了检测和分析,旨在探讨EBNA1 多态性在EBV 阳性淋巴瘤发生中的意义。
本实验采用PCR 方法对有EBER 阳性细胞(包括肿瘤细胞和非肿瘤细胞)的淋巴瘤病例进行EBNA1基因羧基端的扩增,成功扩增15例,并将扩增产物进行凝胶电泳分析。实验结果显示,EBNA1基因羧基端的PCR 扩增产物与EBER 表达情况基本一致,PCR 扩增产物较多的病例主要为弥漫性大B 细胞淋巴瘤、NK/T 细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤,由此说明EBV感染在不同类型淋巴瘤中的表达主要与弥漫大B 细胞淋巴瘤、NK/T 细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤有关,这与其他地区的研究结果一致;同时也说明EBER 与EBNA1 常常伴随表达。PCR 扩增产物较少的几乎是伴有EBV 潜伏感染的淋巴瘤病例,EBV 在这些淋巴瘤中可能只属于伴随情况,为非致瘤性。
Figure 2. Mutation of aa487 at C-terminal of EBNA1 gene in some lymphomas. A:negative control(wild type);B:mutation of aa487 at the carboxyl end of EBNA1 gene in sample 5 of classical Hodgkin′s lymphoma(GCT→GTT,that was A→V).图2 部分淋巴瘤中EBNA1基因C端AA487位点的突变情况
将扩增产物送至华大基因进行测序分析,测序结果显示,其编码产物为AA439-555,该段序列包含了以往研究中发现的突变热点AA487 及AA466-527之间的变异。与标准株B95-8 相比,15 例EBV 阳性淋巴瘤组织标本中EBNA1 羧基端均出现序列变异。几例非肿瘤细胞EBER阳性的淋巴瘤,也均出现了与以往研究相同的共有突变[10],由此推测,这些EBNA1羧基端突变是否诱发非肿瘤细胞释放了肿瘤发生因子,从而促进淋巴瘤的发生,或者这几例淋巴瘤的发生与EBV无关,EBV感染只是一种潜伏状态,而是通过其他途径导致了肿瘤的发生,这有待于进一步研究。而肿瘤细胞EBER 阳性的淋巴瘤样本中除了有部分共有突变外,均出现了非共有突变,这些突变可能是偶然事件,也可能由于地域差异导致,或是某种类型淋巴瘤的致瘤原因,有待于进一步深入研究。
综上所述,EBV 基因组结构复杂,表达的蛋白及基因产物较多。其与多数肿瘤发生、发展密切相关,目前针对淋巴瘤的研究较多。本实验研究发现,该地区淋巴瘤病例中EBNA1 羧基端变异类型与其他地区除了有部分共有突变外,均出现了非共有突变,这些突变可能是偶然事件,也不可能除外与肿瘤的发生有关或由于地域差异导致,为探索EBV 的致病机制提供了一定价值。