松果菊苷对葡聚糖硫酸钠诱导的实验性结肠炎模型大鼠的保护作用*

贺璐璐， 韩佳瑞， 计树灵， 左振魁△， 段晓宇， 范 飒， 祝康杰

［1河南中医药大学，河南郑州450000；2河南省中医院（河南中医药大学第二附属医院），河南郑州450000］

克罗恩病（crohn disease，CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是炎性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）的主要形式，属于胃肠道慢性非特发性炎性疾病，给患者生理及心理造成终生负担［1］。目前IBD 已成为一种全球性疾病，在新兴工业化国家中其发病率不断上升，在发达国家中IBD 的患病率也已上升到人口的0.3%以上［2］。到目前为止，IBD尚未有特异性的治疗方法。

现代药理学研究显示，松果菊苷（echinacoside，ECH）具有抗氧化［3］、抗凋亡［4］、抗炎［5］及改善血流微循环［6］等药理作用。在动物模型中，ECH 可促进如皮肤［7］、肺脏［8］和肝脏［9］等多种组织损伤的修复。在IBD相关研究中显示，炎症反应和肠屏障破坏伴随着IBD 整个发病和进展过程［10］。鉴于此，推测 ECH 可能具有抗IBD 的潜力。为验证这一假设，本研究用葡聚糖硫酸钠（dextran sulphate sodium，DSS）诱导的大鼠急性结肠炎模型，观察ECH 对DSS 诱导的结肠炎大鼠结肠炎症的调节作用，用以评估ECH 作为抗IBD潜在药物的可能性。

材料和方法

1 材料

1.1 实验动物 40 只 6～7 周龄雄性 SPF 级 SD 大鼠（220～240 g）购自河南省实验动物中心，生产许可证号为SCXK（豫）2017-0001，大鼠饲养于河南省中医院动物实验中心屏障环境动物房［SYXK（豫）2016-0009］，其可自由饮食饮水。本实验已获得河南省中医院实验动物伦理委员会批准，所有实验均符合动物福利的要求。

1.2 试剂与抗体 ECH（纯度98%）购自成都普瑞法科技开发有限公司；DSS（分子量36 000～50 000）购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；大鼠白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、IL-10和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 试剂盒购自江苏酶免实业有限公司；HE 染色试剂盒和Bradford 蛋白浓度测定试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；RIPA 试剂、DAPI 试剂和 ECL 发光底物购自上海碧云天生物科技有限公司；IL-6、TNF-α和Toll 样受体2（Toll-like receptor 2，TLR2）兔单克隆抗体及Alexa Fluor®647 标记的驴抗兔IgG（H+L）购自Abcam；TLR4 和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）兔单克隆抗体购自Cell Signaling Technology；HRP 标记的山羊抗兔IgG（H+L）、生物素标记的山羊抗兔IgG（H+L）、HRP 标记的链霉亲和素及GAPDH兔单克隆抗体购自沈阳万类生物科技有限公司。

2 方法

2.1 急性结肠炎大鼠模型建立与分组 大鼠适应性饲养3 d后，将大鼠随机分为对照（control）组、模型组（DSS 组）、DSS+低剂量ECH（low-dose ECH，ECHL）组和DSS+高剂量ECH（high-dose ECH，ECH-H）组，每组10 只大鼠。根据文献［11］方法，大鼠连续7 d给予饮用4%DSS（饮用水配制），然后正常饮水3 d，以诱导急性实验性结肠炎大鼠。对照组大鼠在整个实验过程中饮用普通水。为评价ECH 对DSS诱导的大鼠急性结肠炎的防护作用，于实验第1～10 天（实验结束），对照组和模型组每天给予生理盐水1 mL灌胃，DSS+ECH-L组及DSS+ECH-H 组每天分别给予20和50 mg/kg ECH灌胃。

2.2 疾病活动指数（disease activity index，DAI）的评估 大鼠每天称重并检查腹泻和便血情况。按照文献［12］评分系统计算 DAI。DAI 为体重减轻率积分（体重减轻率＜5%，计0 分；5%≤体重减轻率≤10%，计1分；10%＜体重减轻率≤15%，计2分；15%＜体重减轻率≤20%，计3 分；体重减轻率＞20%，计4 分）、腹泻积分（无腹泻，计0 分；轻度腹泻，计2 分；水样便，计4分）及便血程度积分（无血，计0 分；轻微出血，计2分；大量出血，计4分）之和。

2.3 结肠标本的收集 在结肠炎诱导后第10 天，过量麻醉处死各组大鼠。取每只大鼠的整个结肠进行长度测量，并纵向打开结肠标本，用生理盐水冲洗。取离远端结肠0.5 cm 的节段，立即置于1.5 mL低温管中，保存于-80 ℃。

2.4 HE 染色 用常规法用石蜡包埋大鼠结肠组织，并将其切为5 μm 厚的切片。切片经脱蜡至水后，根据试剂盒操作步骤进行HE 染色。200 倍光学显微镜下观察并采集结肠组织HE 染色图像。按照文献［13］方法，根据结肠形态学标准进行病理学评分以评估结肠损伤。

2.5 免疫组织化学染色 取大鼠结肠组织切片（5 μm 厚），脱蜡至水后，用0.3%双氧水处理10 min 以封闭内源性过氧化氢酶，10%山羊血清封闭30 min，室温分别孵育 1∶200 稀释比例的 IL-6 和 TNF-α 兔单克隆抗体2 h，PBS 洗涤后，室温孵育1∶200 稀释比例的生物素标记的山羊抗兔IgG（H+L）1 h，再次PBS洗涤后，室温孵育1∶200 稀释比例的HRP 标记的链酶亲和素 45 min，PBS 洗涤后，DAB 显色 5 min，自来水冲洗，苏木素染核，依次常规分化、蓝化和脱水后，用中性树脂封片，在200 倍光学显微镜观察染色情况并采集结肠组织免疫组化染色图像。

2.6 ELISA 检测 取大鼠结肠组织，用RIPA 匀浆，并用Bradford 蛋白浓度测定试剂盒检测匀浆液中蛋白含量。根据ELISA 试剂盒说明书操作步骤，检测匀浆液中 IL-1β、IL-6、IL-10 和 TNF-α 含量。结肠组织中 IL-1β、IL-6、IL-10 和 TNF-α 水平表示为匀浆液中 IL-1β、IL-6、IL-10 和 TNF-α 含量/匀浆液中蛋白含量。

2.7 免疫荧光染色 取大鼠结肠组织切片（5 μm厚），脱蜡至水后，用0.3%双氧水处理10 min以封闭内源性过氧化氢酶，10%驴血清封闭30 min，加入1∶400 稀释比例的TLR2 兔单克隆抗体，4 ℃下孵育过夜；PBS 洗涤后，室温避光孵育1∶400 稀释比例的Alexa Fluor®647 标记的驴抗兔IgG（H+L）1 h，PBS 再次洗涤后，DAPI 试剂染核，然后在荧光显微镜下观察并采集图像。

2.8 Western blot 法检测蛋白水平 RIPA 萃取结肠组织全蛋白，用Bradford蛋白浓度测定试剂盒将各组蛋白样品定量至相同浓度后，取20 μg蛋白进行SDSPAGE。将电泳后的蛋白转移至甲醇预活化的PVDF膜。用5%脱脂牛奶室温下封闭膜1 h，4℃孵育1∶1 000 的稀释比例的兔单克隆抗体（TLR2、TLR4 和NF-κB和GAPDH）过夜。次日，以TBST洗涤后，室温孵育1∶1 000 的稀释比例的HRP 标记的山羊抗兔IgG（H+L）1 h，以TBST 洗涤后，用ECL 发光底物和化学发光成像仪显影。用IPP6.0软件检测蛋白的灰度值。蛋白的相对表达量=目的蛋白的灰度值/GAPDH的灰度值×100%。

3 统计学处理

实验数据均采用均数±标准差（mean±SD）表示，并利用GraphPad Prism 软件进行后续统计学分析。数据在满足正态分布和方差齐的条件下，多组比较采用单因素方差分析法，组间两两比较采用Bonferroni校正。当P＜0.05时认为差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠结肠炎DAI评分及结肠长度比较

与对照组相比，DSS 组大鼠的DAI 显著升高（P＜0.01，图1A），结肠长度显著缩短（P＜0.01，图1B）；与DSS 组 比 较 ，DSS+ECH-L 和 DSS+ECH-H 组 大 鼠 的DAI 显著降低（P＜0.05 或P＜0.01，图1A），结肠长度显著增长（P＜0.05 或P＜0.01，图 1B），其中 DSS+ECH-H组尤为显著（P＜0.01）。

2 各组大鼠结肠的组织学表现比较

HE 染色显示，对照组肠绒毛和肠黏膜正常，固有层腺体正常，基底层正常；DSS 组肠绒毛缩短、排列紊乱且绒毛上皮结构分辨不清甚至消失，肠黏膜和固有层结构破坏（出现炎症细胞浸润、腺体破坏、严重充血和出血现象），基底层变厚；DSS+ECH-L 组肠绒毛缩短和排列不整齐、绒毛上皮结构可分辨，肠粘膜上皮部分破坏有水肿和出血情况，固有层腺体分辨不清；DSS+ECH-H 组肠绒毛长度、排列和结构趋向正常，但绒毛上皮中细胞分辨不清，黏膜组织有少量出血点，固有层腺体结构趋向清晰。组织评分结果显示，与对照组比较，DSS 组组织评分显著增加（P＜0.01）；与DSS 组比较，DSS+ECH-L 和DSS+ECHH 组组织评分显著降低（P＜0.05 或P＜0.01），其中DSS+ECH-H组尤为显著（P＜0.01）。见图2。

3 各组大鼠结肠组织中炎症相关因子表达情况比较

免疫组织化学染色（图3A）显示，对照组大鼠结肠组织中IL-6和TNF-α呈阴性表达；DSS组大鼠结肠组织中IL-6 和TNF-α 呈弥漫强阳性表达；DSS+ECHL 和 DSS+ECH-H 组大鼠结肠组织中 IL-6 和 TNF-α 表达相对DSS 组明显减弱。ELISA 结果（图3B）显示，与对照组比较，DSS 组大鼠结肠组织中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α 水平显著增加（P＜0.01），抑炎因子IL-10 水平显著降低（P＜0.01）；与DSS 组比较，DSS+ECH-L和DSS+ECH-H组IL-1β、IL-6和TNF-α水平均显著降低（P＜0.05 或P＜0.01），IL-10 水平显著增加（P＜0.05 或P＜0.01），其中DSS+ECH-H 组尤为显著（P＜0.01）。

Figure 1. ECH alleviated DSS-induced colitis in rats. A：DAI score of rats in each group；B：colon length of rats in each group.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs DSS group.图1 ECH减轻DSS诱导的大鼠结肠炎

Figure 2. ECH alleviated DSS-induced colonic destruction in rats（HE staining，scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs DSS group.图2 ECH可减轻DSS诱导的大鼠结肠破坏

4 各组大鼠结肠组织中TLRs 及NF-κB 表达情况的比较

TLR2 免疫荧光染色（图4A）显示，DSS 组大鼠结肠组织中TLR2 阳性细胞明显多于对照组；DSS+ECH-L 和 DSS+ECH-H 组大鼠结肠组织中 TLR2 阳性细胞明显少于DSS 组，其中DSS+ECH-H 组数量更少。Western blot 结果（图4B～E）显示，与对照组比较，DSS 组大鼠结肠组织中 TLR2、TLR4 和 NF-κB 表达水平均显著增高（P＜0.01）；与DSS 组比较，DSS+ECH-L 和DSS+ECH-H 组大鼠结肠组织中TLR2、TLR4 和NF-κB 表达水平均显著降低（P＜0.01），其中DSS+ECH-H组尤为显著（P＜0.01）。

讨 论

Figure 3. ECH attenuated DSS-induced colon inflammation in the rats. A：immunohistochemical staining of IL-6 and TNF-α in colon tissues of the rats in each group（scale bar=100 μm）；B：the levels of IL-1β，IL-6，IL-10 and TNF-α in colon tissues of the rats were measured by ELISA. Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs DSS group.图3 ECH可减轻DSS诱导的大鼠结肠中炎症反应

IBD 发病机制复杂多样，迁延难愈，目前传统的西医治疗效果尚不十分理想［2］。本研究以DSS 诱导的大鼠急性结肠炎模型来评估ECH 潜在的抗IBD 的作用，结果显示，ECH 可明显改善结肠炎大鼠的DAI积分和病理改变等症状，提示，ECH 是潜在的治疗IBD的候选药物。

正常情况下，结肠组织中炎症因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）与抗炎因子（IL-10）处于平衡状态，当炎症出现时，嗜中性粒细胞、肠上皮细胞及其他类型细胞共同通过分泌促炎因子启动炎症反应来进一步激活适应性免疫系统［14］。有研究表明，在IBD 小鼠结肠组织中IL-1β、IL-6、TNF-α 的水平急剧升高［15］，而抗炎因子IL-10 在这一过程中会出现下降［14］。本研究结果也显示在DSS 诱导的大鼠结肠炎模型中，大鼠结肠组织中的 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的水平明显升高，IL-10 水平明显下降，而ECH 治疗可在一定程度上逆转结肠组织中炎症因子失衡这一现象，从而减轻IBD过程中炎症损伤的程度。

Figure 4. ECH inhibited DSS-induced hyperactivation of TLRs/NF-κB signaling pathways in colon tissues of the rats. A：the image of immunofluorescence staining for TLR2 in the colon tissue of rats in each group（scale bar=50 μm）；B，C，D and E：the expression levels of TLR2，TLR4 and NF-κB in colon tissues of the rats in each group were detected by Western blot. Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs DSS group.图4 ECH可抑制DSS诱导的大鼠结肠组织中TLRs/NF-κB信号通路的过度激活

TLR 是天然免疫的第一道屏障，能识别侵入体内的微生物进而激活免疫细胞应答的作用，现已被证实其在IBD 的发生及发展中发挥着重要的作用［16］。TLR2 和 TLR4 是较早发现并报道的 TLRs 家族成员，能够直接介导机体与病原体之间的反应［17-18］。Li 等［19］在 LPS 诱导的大鼠急性肠损伤模型中发现LPS 能诱导大鼠回肠上皮细胞凋亡，提高其回肠组织中TLR4 的mRNA 表达水平，磷酸化NF-κB抑制因子α 并导致其降解，从而诱导巨噬细胞炎性蛋白和回肠髓过氧化物酶的产生。另有研究［12］报道，TLR2 可识别肠道内致病菌DNA，并在活化后表达升高，继续激活下游炎症介质，说明TLR2 也可参与肠道免疫反应。既往的研究说明TLR2及TLR4在IBD 大鼠肠道的免疫及炎症稳态中发挥着不可或缺的作用，本研究结果也显示在DSS 诱导的结肠炎模型中，大鼠结肠组织中的TLR2及TLR4均明显升高，同时其下游因子NF-κB 表达水平也明显升高，说明在DSS 诱导的大鼠结肠炎模型中结肠组织存在TLRs/NF-κB 炎症通路的过度激活，而 ECH 治疗后TLR2、TLR4 及 NF-κB 表达水平均明显下降，表明ECH 可在一定程度上抑制DSS 诱导的TLRs/NF-κB炎症通路的激活从而发挥其抗炎作用。

综上所述，ECH 能改善DSS 大鼠结肠炎症状（包括结肠长度、DAI 评分、组织结构形态、炎症反应等均明显减轻），且能抑制TLR/NF-κB 通路的活性，说明ECH 对DSS诱导的实验性结肠炎模型大鼠具有一定的治疗作用。