杜仲皮水提取物调节circFADS2靶向miR-491-5p干预类风湿性关节炎滑膜成纤维样细胞生长与凋亡*

郑国洪， 孙 斌， 王晶晶， 杨正明

（1浙江省舟山市中医院急诊骨伤科，浙江舟山316000；2浙江省舟山市中医院骨关节科，浙江舟山316000；3宁波龙赛医院骨伤科，浙江宁波315299；4浙江大学医学院附属第二医院骨科，浙江杭州310009）

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性自身免疫性疾病，成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）在 RA 发病中起重要作用，FLS 的过度增殖可介导炎症反应，造成关节结构破坏；抑制滑膜成纤维样细胞的异常增殖是治疗类风湿关节炎的重要策略［1-2］。研究表明中医药在治疗RA中具有良好效果［3］。中药杜仲为杜仲科植物杜仲的树皮，是我国特有的一种名贵中药材，其含有多种活性成分，具有保护关节软骨、抗骨性关节炎以及抗膝骨关节炎滑膜炎病变的药理作用［4-5］。研究报道杜仲提取物通过调节体内和体外的炎症，滑膜细胞增殖和破骨细胞形成来改善关节炎［6］。杜仲的树皮，叶子和雄花提取物通过抑制炎症减轻骨质破坏［7］。杜仲皮水提取物可能通过激活PI3K/Akt-eNOS 信号通路治疗大鼠急性骨髓炎［8］。然而杜仲皮水提取物对RA-FLS生长与凋亡的影响及机制尚不清楚。

研究报道脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）处理的软骨细胞中环状RNA-FADS2（circular RNAFADS2，circFADS2）高表达，沉默circFADS2降低了LPS 处理的软骨细胞增殖，提高了细胞凋亡水平［9］。生物学软件预测发现circFADS2 与微小RNA-491-5p（microRNA-491-5p，miR-491-5p）有结合位点。miR-491-5p 下调可促进血管平滑肌细胞的增殖和迁移，并抑制细胞凋亡，减缓动脉粥样硬化进程［10］。然而circFADS2和miR-491-5p对RA-FLS 增殖与凋亡的影响及其关系尚不清楚。本实验旨在研究杜仲皮水提取物（water extract ofEucommiaecortex，WEEC）对RA-FLS 生长与凋亡的影响及机制是否与调节circ-FADS2、miR-491-5p有关。

材料和方法

1 细胞与试剂材料

RA-FLS 购自 Cell Applications；DMEM 培养基和胎牛血清购自Gibco；CCK-8 试剂盒和凋亡检测试剂盒购自上海吉至生化科技有限公司；RIPA 蛋白裂解液购自上海碧云天生物公司；总RNA 提取试剂盒购自艾美捷科技有限公司；萤光定量PCR 试剂盒购自上海科敏生物科技有限公司；双萤光素酶报告基因检测试剂盒购自GeneCopoeia；杜仲皮购自亳州市安宝堂生物科技有限公司。

2 杜仲皮水提取物的制备

将杜仲皮粉碎后过60 目筛网，称取40 g 粉末置于1 000 mL 的无菌蒸馏水中煮沸4 h，用300 目筛网过滤，收集滤液，水浴浓缩蒸发干液体，然后加蒸馏水配制成浓度为3 g/L的WEEC。

3 实验方法

3.1 细胞处理与分组 RA-FLS 用含10%胎牛血清的DMEM 培养基培养，取对数生长期细胞，分别用0.1、0.3、0.9 和 2.7 g/L 的 WEEC 处理，作为不同浓度WEEC 组，以常规培养的细胞作为正常对照（normol control，NC）组；将pcDNA、pcDNA-circFADS2、anti-miR-NC 和 anti-miR-491-5p 转 染 至 RA-FLS 后 用0.9 g/L 的 WEEC 处理，记为 pcDNA+WEEC 组、pcDNA-circFADS2+WEEC组、anti-miR-NC+WEEC组、anti-miR-491-5p+WEEC 组；将 pcDNA-circFADS2 分别与 miR-NC 和 miR-491-5p 共转染至 RA-FLS，而后用0.9 g/L 的 WEEC 处 理 ，记 为 miR-NC+pcDNA-circ-FADS2+WEEC 组 、miR-491-5p+pcDNA-circFADS2+WEEC组。

3.2 CCK-8 法检测细胞活力 各组细胞培养24 h，每孔中加入10 μL CCK-8试剂，孵育2 h，酶标仪检测各组细胞450 nm 波长处的吸光度（A）值，以对照组细胞活力为100%，换算为细胞活力。

3.3 流式细胞术检测细胞凋亡率 各组细胞培养24 h，收集细胞，用预冷的PBS 漂洗2 次，用结合缓冲液重悬，然后加入Annexin V-FITC 和PI 溶液一起避光孵育15 min；用流式细胞术分析细胞凋亡率。

3.4 Western blot法检测蛋白水平 收集各组细胞，加入RIPA 裂解液提取总蛋白，将裂解物经10%的SDS-PAGE 分离蛋白，转移至PVDF 膜上，室温下用5%脱脂牛奶封闭膜1 h，然后在4 ℃下与Ⅰ抗孵育过夜，室温与Ⅱ抗孵育2 h，曝光显影后用Image J 软件分析蛋白条带灰度值，以GAPDH 为内参照计算蛋白的相对水平。

3.5 RT-qPCR 检测 circFADS2 和 miR-491-5p 的表达水平 收集各组细胞，提取总RNA，取1 μg RNA制备cDNA，然后进行qPCR，循环条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40 个循环；72 ℃ 5 min；以 GAPDH 和 U6 为内参照，用 2-△△Ct法计算相对表达量。circFADS2 的上游引物序列为5′-CATGGGGAAGGGAGGGAACC-3′，下游引物序列为5′-GGGTGCTGGATGG ACCATTT-3′；GAPDH 的上游引物序列为 5′-GATATTGTTGCCATCAATGAC-3′，下游 引 物 序 列 为 5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′；miR-491-5p 的 上 游 引 物 序 列 为 5′-GGAGTGGGGAACCCTTCC-3′，下 游 引 物 序 列 为 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6 的 上 游 引 物 序 列 为 5′-CTTCGGCAGCACATATAC-3′，下游引物序列为 5′-GAACGCTTCACGAATTTGC-3′。

3.6 双萤光素酶报告实验 构建circFADS2野生型和突变型萤光素酶载体，将其分别与miR-NC或miR-491-5p 共转染至RA-FLS 中，按照说明书检测萤光素酶活性。将 si-NC、si-circFADS2、pcDNA 和 pcDNA-circFADS2 转染至 RA-FLS 中，用 RT-qPCR 检测 miR-491-5p的表达水平。

4 统计学处理

所有数据均使用SPSS 22.0软件统计分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（mean±SD）表示，两组间比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 不同浓度杜仲皮水提取物对RA-FLS 细胞活力与凋亡的影响

与 NC 组比较，不同浓度 WEEC 组 RA-FLS 细胞活力降低，凋亡率升高，cleaved caspase-3 蛋白水平升高（P＜0.05），见图1、表1。

表1 不同浓度杜仲皮水提取物对RA-FLS活力、凋亡及circFADS2和miR-491-5p 表达水平的影响Table 1. Effects of WEEC at different concentrations on the viability，apoptosis，and circFADS2 and miR-491-5p expression in the RA-FLS（Mean±SD. n=9）

2 circFADS2 和anti-miR-491-5p 均能逆转杜仲皮水提取物对RA-FLS细胞活力与凋亡的干预作用

与 pcDNA+WEEC 组比较，pcDNA-circFADS2+WEEC 组的circFADS2 表达水平升高，细胞活力升高，细胞凋亡率及cleaved caspase-3 蛋白水平降低（P＜0.05），见图2A、表2。

与 anti-miR-NC+WEEC 组比较，anti-miR-491-5p+WEEC 组的miR-491-5p 表达水平降低，细胞活力升高，细胞凋亡率及cleaved caspase-3 蛋白水平降低（P＜0.05），见图2B、表2。

表2 pc-DNA-circFADS2和anti-miR-491-5p能逆转杜仲皮水提取物对RA-FLS细胞活力与凋亡的干预作用Table 2. pc-DNA-circFADS2 or anti-miR-491-5p reversed the effect of WEEC on the viability and apoptosis of RA-FLS（Mean±SD.n=9）.

Figure 1. The effect of different concentrations of WEEC on the apoptosis of RA-FLS. A：flow cytometry was used to analyze the apoptosis of RA-FLS；B：Western blot was used to determine the relative protein level of cleaved caspase-3 in RA-FLS.图1 不同浓度杜仲皮水提取物对RA-FLS凋亡的影响

3 circFADS2靶向调控miR-491-5p的表达

StarBssae 预测显示 circFADS2 和 miR-491-5p 有互补的核苷酸序列；circFADS2 野生型报告质粒与miR-491-5p 共转染的细胞萤光素酶活性显著降低（P＜0.05），而 circFADS2 突变型报告质粒与 miR-491-5p 共转染的细胞萤光素酶活性的差异无统计学显著性（P＞0.05）。抑制circFADS2表达后，miR-491-5p 的表达水平升高；过表达circFADS2 后，miR-491-5p的表达水平降低（P＜0.05），见图3。

Figure 2. The representitive images of Western blot for detemining the protein levels of cleaved caspase-3 in the RA-FLS.图2 Western blot检测cleaved caspase-3蛋白水平的变化

4 miR-491-5p可逆转pcDNA-circFADS2对WEEC处理的RA-FLS细胞活力与凋亡的影响

与miR-NC+pcDNA-circFADS2+WEEC 组比较，miR-491-5p+pcDNA-circFADS2+WEEC 组 的 miR-491-5p 表达水平升高，细胞活力降低，细胞凋亡率及cleaved-caspase-3 蛋白水平升高（P＜0.05），见图2C、表3。

表3 miR-491-5p可逆转pcDNA-circFADS2对杜仲皮水提取物处理的RA-FLS细胞活力与凋亡的影响Table 3. miR-491-5p reversed the effects of pcDNA-circFADS2 on the viability and apoptosis of WEEC-treated RA-FLS（Mean±SD.n=9）

讨 论

成纤维样滑膜细胞是RA 患者滑膜组织中的主要细胞类型之一，其可通过产生炎症细胞因子以及过度增殖在RA 发病机理中起关键作用，诱导FLS 凋亡是中草药治疗RA 的重要机制［11-12］。杜仲有强筋骨的作用，为骨伤科常用药物之一，杜仲及其有效成分具有较强的抗骨质疏松症活性，能通过诱导成骨细胞增殖、调节骨代谢、提高骨密度等途径发挥对骨损伤的保护作用［13-15］。研究报道杜仲皮水提取物通过抑制PI3K/Akt 途径抑制软骨变性，减少炎症细胞因子分泌，从而抑制骨关节炎的进展［16］。杜仲醇提取物体外能有效抑制RA-FLS 的增殖［17］。以上研究表明杜仲相关提取物具有治疗骨损伤及关节炎等相关疾病的作用。本实验用不同浓度杜仲皮水提取物处理RA-FLS，结果显示，RA-FLS 的细胞活力降低，凋亡率及cleaved caspase-3 蛋白表达水平升高，说明杜仲皮水提取物抑制了RA-FLS 增殖，并促进其凋亡，提示杜仲皮水提取物可能具有治疗RA 的作用。

Figure 3. Targeted regulation of miR-491-5p expression by circFADS2. A：StarBssae predicts the targeting relationship between circFADS2 and miR-491-5p；B：detection of dual luciferase activity after co-transfection of miR-NC or miR-491-5p with wild-type and mutant reporter plasmids into RA-FLS cells；C：RT-qPCR to detect the expression of circFADS2；D：RT-qPCR to detect the expression of miR-491-5p. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs miR-NC group；△P＜0.05 vs si-NC group；#P＜0.05 vs pcDNA group.图3 circFADS2靶向调控miR-491-5p的表达

研究表明circRNA 广泛参与了RA 滑膜细胞持续增生，滑膜炎症，滑膜的纤维样改变等［18］，如circ0088036的上调促进了RA-FLS的增殖和迁移［19］。circAFF2 通过miR-375/TAB2 信号通路促进RA-FLS的增殖和炎症反应［20］。已有研究报道circFADS2 影响软骨细胞增殖及凋亡［9］，但 circFADS2 对 RA-FLS增殖、凋亡的影响尚不清楚。本实验结果显示，不同浓度杜仲皮水提取物处理后的RA-FLS 中circFADS2表达水平降低，miR-491-5p 表达水平升高；而转染circFADS2 过表达载体或miR-491-5p 抑制表达载体后，用杜仲皮水提取物处理，细胞活力升高，细胞凋亡率及cleaved caspase-3 蛋白水平降低；表明过表达circFADS2或抑制miR-491-5p表达可促进RA-FLS 生长，抑制其凋亡，两者均可逆转杜仲皮水提取物对RA-FLS 活力、凋亡的干预作用。本实验还表明circ-FADS2 可靶向负调控 miR-491-5p，且 miR-491-5p 过表达可逆转circFADS2 对杜仲皮水提取物处理的RA-FLS生长与凋亡的影响。

综上所述，杜仲皮水提取物可通过调节circ-FADS2/miR-491-5p 表达，抑制类风湿性关节炎滑膜成纤维样细胞生长，并促进其凋亡。