SRT1720靶向激活SIRT1抑制NLRP3炎症小体活化缓解病理性疼痛*

杨荷雨， 王招娣， 赵佳佳， 谢 敏， 朱海丽

（湖北科技学院药学院，湖北咸宁437100）

疼痛是指对实际或潜在身体伤害的有害刺激的进化保护性感觉，与炎症发生的区域有关［1］。与生理性疼痛相反，炎症性疼痛源于组织损伤，它启动了伤害性神经纤维末梢的激活。在炎症反应过程中，对有害刺激的反应增强（痛觉过敏）或由正常的无害刺激（异常性疼痛）触发疼痛［2］。炎症通路通常由外周创伤或损伤触发，疼痛性损伤后大脑中的神经胶质细胞激活增多，表明神经胶质细胞的激活在神经炎症和痛敏中发挥重要调节作用。在病理性疼痛状态下，脊髓小胶质细胞被激活，释放促炎因子和增强脊髓神经元兴奋性的生长因子，维持疼痛［3］。

人源 SIRT1（NAD-deperdent protein deacetylase sirtuin 1）是 Sir2（silent information regulator 2）超蛋白家族成员之一，是NAD+依赖型的去乙酰化酶，能够催化组蛋白底物和非组蛋白底物的乙酰赖氨酸进行去乙酰化，在染色质重塑、基因调控、代谢和肿瘤等相关疾病中发挥重要作用［4］。SIRT1 的表达和活性在炎症性疼痛、神经病理性疼痛及骨癌痛模型的动物脊髓中均下调［5］。SIRT1 激活剂白藜芦醇、SRT1720和NAD 鞘内处理可显著减轻动物机械痛过敏和热痛过敏，而抑制SIRT1 活性或下调其表达可阻断其抗伤害效应［6］。

为了明确并阐明SIRT1 在病理性疼痛中的作用及机制，运用SRT1720 作用于肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及完全弗氏佐剂（complete Freund′s adjuvant，CFA）-诱导的疼痛模型大鼠，检测SIRT1活性上调对大鼠痛觉行为学的影响，并探讨其病理机制，为病理性疼痛小分子镇痛药物的开发提供理论支持。

材料和方法

1 实验材料

1.1 实验动物 本实验中使用的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠购于湖北省实验动物中心，180～200 g，6～8 周龄，合格证编号为 42000600041944。将大鼠饲养在（22±2）℃环境中，以12/12 h光/暗循环并提供充足的水和食物。

1.2 主要试剂 蛋白酶抑制剂、加强型放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）buffer、SDS-PAGE 凝胶快速配制试剂盒和BCA 蛋白浓度测定试剂盒均购于上海碧云天生物技术有限公司；抗离子钙接头蛋白1（ionized calcium binding adaptor molecule 1，Iba1；ab5076）和抗 SIRT1（ab110304）抗体购自Abcam；抗p-SIRT1-S47（AP0976）、抗白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β；A11370）和抗NLRP3（A12694）抗体购自ABclonal；HRP 标记山羊抗兔IgG购自ABclonal；辣根过氧化物酶标记驴抗山羊IgG（H+L）购自碧云天。

2 主要方法

2.1 模型建立及分组处理 构建TNF-α-急性痛大鼠模型：剔除大鼠背部注射部位毛发并进行皮肤表面消毒，用无菌微量注射器于L5和L6脊椎棘突间隙垂直进针，进入蛛网膜下腔，缓慢倾斜45°注入10 μL（10 ng）TNF-α；对照组注射相同剂量的生理盐水。药物处理：大鼠随机分为溶剂对照组（control 组）和SRT1720给药组。TNF-α注入30 min后，溶剂对照组鞘内注射 10 μL DMSO+生理盐水，SRT1720 组鞘内注射 10 μL（200 μg）SRT1720 溶液。SRT1720 溶解在DMSO 中，使用前用生理盐水按体积比1：1 进行稀释。构建CFA-慢性炎症痛大鼠模型：大鼠左后肢注射50 μL完全弗氏佐剂，对照组注射同剂量的生理盐水［7］。药物处理：CFA模型构建7 d后，溶剂对照组鞘 内 注 射 10 μL DMSO+生 理 盐 水（v/v=1∶1），SRT1720组鞘内注射10 μL（200 μg）体积的SRT1720溶液。

2.2 大鼠自发性缩足反射（Flinches）次数的记录大鼠置于长、宽、高均为30 cm的透明有机玻璃盒内，玻璃平板位于实验平台高50 cm 的支架上。实验开始前，将大鼠放置于玻璃盒中适应30 min，观察并记录每5 min 内大鼠自发性缩足（或舔爪）反射次数，记录3次。脊髓鞘内注射TNF-α，放回盒内30 min后记录每5 min 内缩足（或舔爪）次数，记录3 次。进而，继续鞘内注射溶剂对照或SRT1720，30 min后记录每5 min内缩足（或舔爪）次数，记录3次。

2.3 50%缩足阈值（paw withdrawal threshold，PWT）的检测 各组给药后 0、2、4 和 6 h，根据 up-down 法检测50% PWT。方法如下：实验前让大鼠在玻璃箱中适应环境30 min。用Von Frey 纤维（0.4～26 g）对大鼠后足底正中部进行垂直剌激。动物受刺激后，若出现舔足或抬足等行为视为阳性反应，反之则为阴性反应。测定大鼠的力度从2 g 开始，最大力度为26 g，当力度超过26 g 时也计为26 g。对大鼠进行刺激而没出现任何阳性反应时，应该用相邻高的力度再次刺激；对大鼠进行刺激后很快出现阳性反应时，应该用相邻低的力度再次进行刺激。记录6 次数据后结束检测。50%PWT（g）=10Xf+Kδ/10 000，Xf 为本次行为学测试中使用的最后一个Von Frey 纤维的阶数，K 为痛觉阈矫正系数，δ 为相邻不同纤维刺激之间的差异。

2.4 Western blot 法检测脊髓组织中蛋白的表达行为学记录结束后，动物注射过量麻醉剂（10%水合氯醛5 mL/kg），脱颈处死，分离脊柱，暴露脊髓，分离腰段脊髓置于预冷的RIPA 裂解液（临用前加入蛋白酶抑制剂cocktail）中进行匀浆。收集组织裂解液于离心管中，12 000 r/min，4 ℃离心15 min，收集上清，BCA 法检测上清中的蛋白浓度。SDS-PAGE 分离蛋白样品，转至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭l h，加入Ⅰ抗4℃条件下孵育过夜。加入Ⅱ抗孵育1 h 后，LAS500 凝胶成像系统扫描观察，ImageJ 软件分析条带灰度值。

2.5 免疫荧光法检测脊髓组织中Iba1 的蛋白表达和定位 动物麻醉后，用4%多聚甲醛灌流固定，剥取脊髓，脱水包埋，制作石蜡切片。石蜡切片脱蜡，PBS 漂洗，封闭，加入Ⅰ抗孵育过夜，PBS 洗 3 次，荧光素标记Ⅱ抗染色标记，漂洗，封片，荧光显微镜观察，ImageJ软件分析荧光强度值［8］。

3 统计学处理

采用SPSS 26.0 软件进行统计学分析。数据资料以均数±标准差（mean±SD）表示。组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

结 果

1 SRT1720鞘内给药缓解大鼠TNF-α所致急性痛

以大鼠自发性缩足（或舔爪）反射（Flinches）次数评估大鼠自发性疼痛情况。如图1 所示，与对照组（control组）相比，脊髓鞘内注射TNF-α（TNF-α 组）引发大鼠外周痛觉过敏。为了检测SRT1720对TNF-α-诱导急性痛的作用，记录鞘内给药SRT1720 后大鼠自发性缩足（或舔爪）反射次数。结果显示，SRT1720 给药（TNF-α+SRT1720 组）大鼠的自发缩足次数显著减少（P＜0.05）。单独注射 SRT1720 后（control+SRT1720组）缩足次数的差异无统计学显著性（P＞0.05），表明SRT1720 对正常大鼠的行为学没有影响。该结果表明，鞘内注射SRT1720激活SIRT1可有效缓解TNF-α诱导的急性痛觉过敏。

Figure 1. The effect of SRT1720 treatment on TNF-α-induced painful behavior in the animals with acute pain.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs TNF-α group.图1 SRT1720处理对TNF-α诱导的急性痛动物痛觉行为的影响

2 SRT1720 鞘内给药缓解大鼠CFA 所致慢性炎症痛

足底注射CFA 后，大鼠同侧后爪机械痛阈值降低（P＜0.05，图2A）；SRT1720 给药后2～6 h 机械痛阈值增加（P＜0.05，图2A）。大鼠对侧后爪机械痛阈值变化在给药前后没有统计学意义（P＞0.05，图2B）。上述结果表明SRT1720鞘内给药可以缓解CFA 诱导的慢性炎症痛。

Figure 2. The effect of SRT1720 treatment on the pain behavior of the animals with chronic inflammatory pain induced by CFA. A：PWT values of ipsilateral hind paw in control group，CFA group，and CFA+SRT1720 group；B：PWT values of contralateral hind paw in control group，CFA group，and CFA+SRT1720 group. Mean±SD. n=6 .*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CFA group.图2 SRT1720处理对CFA诱导的慢性炎症痛动物痛觉行为的影响

3 SRT1720鞘内给药激活SIRT1信号

Western blot 实验结果显示，TNF-α 和 CFA 诱导后脊髓组织中SIRT1 在S47 位点的磷酸化水平显著降低；经 SRT1720 处理后 TNF-α 组和 CFA 组 SIRT1磷酸化水平均显著升高（图3A、B）。以磷酸化SIRT1和总SIRT1表达水平的比值表示SIRT1的活性，如图3C、D 所示，SRT1720 处理可显著增加 TNF-α 和 CFA诱导的SIRT1活性下调（P＜0.05）。

Figure 3. SRT1720 treatment restored the decreased SIRT1 activity-induced by TNF-α and CFA. A and B：Western blot analysis of SIRT1 protein expression and phosphorylation level at Ser47 in different groups；C and D：ImageJ software was used to quantify the gray degree values. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs TNF-α group；△P＜0.05 vs CFA group.图3 SRT1720处理恢复TNF-α和CFA诱导的SIRT1活性降低

4 SRT1720 抑制脊髓小胶质细胞活化并降低脊髓炎症反应

为了阐明SRT1720 缓解病理性疼痛的机制，用Western blot分析检测脊髓腰段组织中小胶质细胞活化的程度及炎症因子的表达水平。本研究用小胶质细胞的特异性标记物Iba1的表达水平表征小胶质细胞的活化水平，以NLRP3 炎症小体和IL-1β 的表达水平表征炎症反应的程度。如图4 所示，TNF-α 和CFA 诱导后脊髓组织中 Iba1、NLRP3 和 IL-1β 表达均上调，表明小胶质细胞激活同时伴随促炎症因子表达增加；SRT1720 鞘内给药后，Iba1、NLRP3 和 IL-1β水平均下调（P＜0.05）。如图5 所示，CFA 诱导后脊髓组织中Iba1 荧光强度增加。该结果表明SRT1720鞘内给药可降低小胶质细胞激活介导的细胞炎症反应。

讨 论

炎症反应引起细胞变化和免疫反应从而导致受损组织的修复和受损组织部位的细胞增殖（生长）［9］。中枢神经系统炎症疾病和小胶质细胞的功能息息相关。神经炎症的特征在于激活外周神经胶质细胞，以及脊髓和大脑中神经胶质细胞，包括小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞［10］。作为中枢神经系统的主要免疫细胞类型，小胶质细胞不断地监测环境中外来的（细菌或病毒）和内源性（DNA、RNA 和蛋白质）的有害信号［11］。在神经未受损伤时，小胶质细胞处于静息状态，形态呈分枝状；一旦发生神经损伤、外伤或感染，小胶质细胞会由静息态变为激活态，胞体出现肥大和增生，细胞突起回缩。在损伤的早期，小胶质细胞适度活化，将外来入侵的病原体和死亡的细胞清除，从而维持突触发生、神经元结构和功能的稳定性以及血脑屏障的完整性［12］。在损伤的后期，持续性的炎症痛导致小胶质细胞过度激活，分化为M1 型（促炎型）和M2 型（抗炎型）。正常情况下，两种激活态细胞保持动态平衡；神经损伤后，活化的小胶质细胞更倾向于分化为M1 型，小胶质细胞能释放有神经毒性的促炎因子，如肿瘤坏死因子、一氧化氮和白细胞介素等［13］，触发炎症级联反应。

Figure 4. The effect of SRT1720 treatment on spinal cord microglia and inflammatory signals. A and B：Western blot analysis of Iba1，NLRP3，and IL-1β protein levels in different groups；C and D：ImageJ software was used to quantify the gray degree values. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs TNF-α group；△P＜0.05 vs CFA group.图4 SRT1720处理对脊髓小胶质细胞活化和炎症信号的作用

Figure 5. Fluorescence intensity of Iba1 in spinal cord of rats. A：representative images of Iba1 immunofluorescence staining on spinal dorsal horn from control and CFA rats（scale bars：the first line=100 μm；the second line=20 μm）；B：quantitative analysis of Iba1 fluorescence intensity in the spinal cord. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group.图5 CFA诱导脊髓小胶质细胞激活

小胶质细胞介导的神经炎症与多种神经退行性疾病相关，且小胶质细胞的激活和NLRP3 炎症小体增加相关。NLRP3 是一种细胞质蛋白，被称为炎症小体的炎症信号复合体。小胶质细胞慢性激活引起NLRP3 炎症小体介导的促炎细胞因子的释放［14］。NLRP3炎症小体由NLRP3、ASC和caspase-1组成，过度激活后释放 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 等促炎细胞因子，介导炎症反应，进一步损伤神经细胞。本研究结果显示，TNF-α 和 CFA 处理均可上调 Iba1、NLRP3 和IL-1β的表达，表明小胶质细胞激活伴随NLRP3炎症小体表达上调。因此抑制小胶质细胞和NLRP3炎症小体的活性可作为治疗中枢神经系统炎症等相关疾病的潜在治疗靶点。

NLRP3炎症小体激活的启动信号的主要介质是NF-κB，该核转录因子可诱导 NLRP3 和 pro-IL-1β 的转录表达［15］。SIRT1 能够调控 NF-κB p65 亚单位乙酰化修饰，上调NF-κB 活性，调控炎症反应的发生发展［16］。NLRP3炎症小体组装活化后导致caspase-1的自我切割和活化，进而将pro-IL-1β 和pro-IL-18 加工成成熟的形式，引发炎症［17］。

SRT1720是一种特异性SIRT1激活剂，对同系物SIRT2 和SIRT3 的激活作用较弱（弱230 倍以上），我们研究中鞘内注射SRT720激活SIRT1并研究其作用机制［18］。我们发现 SRT1720 特异性激活 SIRT1 可显著抑制脊髓小胶质细胞所介导的NLRP3炎症小体的激活及炎症反应。本研究表明SIRT1 活性增加可显著下调 Iba1、NLRP3 和 IL-1β 的表达同时伴随大鼠痛觉敏感性下降。SRT1720 激活SIRT1 能够减轻小胶质细胞介导的神经炎症及抑制NLRP3 炎症小体的激活。

综上所述，SRT1720激活脊髓SIRT1活性可抑制脊髓炎症信号并缓解炎症诱导的动物痛觉行为，发挥镇痛作用，该研究结果的取得为病理性疼痛的治疗提供研究依据，有助于镇痛药物的研发。