王重阳 , 金海南 , 刘思奇 , 张雅琳 , 宋艺兰 , 延光海 △, 金永德 △
(1延边大学吉林省过敏性常见疾病免疫与靶向研究重点实验室,吉林延吉133002;2延边大学附属医院耳鼻喉科,吉林延吉133002;3延边大学医学院解剖教研室,吉林延吉133002)
慢性鼻窦炎(chronic rhinosinusitis,CRS)是最常见的慢性炎症性疾病之一,我国的患病率约为8%[1],欧美国家的患病率更高,约为 10.9%~11.9%[2]。CRS 不仅严重影响患者的生活质量,同时也消耗了大量的医疗资源。CRS 目前分为有鼻息肉的CRS(CRS with nasal polyps,CRSwNP)和无鼻息肉的CRS(CRS without nasal polyps,CRSsNP)。CRSwNP 的主要特征是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)水平升高及细胞外基质(extracellular matrix,ECM)中显著水肿形成[3]。MMPs 构成锌和钙依赖性蛋白酶家族,在蛋白质降解中起关键作用。MMPs与其金属蛋白酶组织抑制物之间的不平衡可导致水肿形成,是CRSwNP 组织重塑的主要机制之一[4]。以往的研究表明,MMPs 可能是肿瘤的重要潜在治疗靶点[5]。目前,CRSwNP 的发病机制仍不清楚。因此,进一步研究CRSwNP 的病理机制,发现其潜在治疗靶点十分有必要。
白细胞介素17A(interleukin-17A,IL-17A)是一种主要由辅助性T 细胞17(T helper 17 cells,Th17 细胞)产生的促炎细胞因子,已被证明与各种慢性炎症和自身免疫疾病有关[6-7]。据报道,使用抗IL-17A 或IL-17 受体A(IL-17 receptor A,IL-17RA)抗体可抑制TRAF6/NF-κB 信号通路,从而缓解广州血管圆线虫诱导小鼠的嗜酸性脑膜炎[8]。Krueger 等[9]证实Secukinumab(一种选择性抑制IL-17A 的人类抗体)治疗减少了银屑病的面积和严重程度。然而,抗IL-17A治疗在CRSwNP中是否有效的研究尚未见报道。因此,本研究旨在探讨IL-17A 在CRSwNP 中的表达及其作用机制。
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信号通路是一种蛋白质-丝氨酸/苏氨酸激酶级联反应,包括激活效应激酶ERK1/2 的双特异性 MAPK 激酶 1/2(MAPK kinase 1/2,MEK1/2)。该通路参与多种核转录因子,包括细胞增殖、凋亡、分化、炎症反应和其他生物学过程[10]。此外,线粒体膜电位、线粒体氧化应激和线粒体能量代谢也受到 p38 MAPK/ERK 通路的调节[11]。MAPK由于其在不同细胞类型、特定时间点和特定微环境中的差异,在CRSwNP 组织重塑过程中的作用比较复杂,有待进一步阐明。此外,我们对IL-17A 和MAPK 在CRS 反应过程中的相关性知之甚少。因此,我们探讨IL-17A 是否通过p38 MAPK/ERK1/2 信号通路增加慢性鼻窦炎中MMP-9 的异常表达,以期为临床CRSwNP的治疗寻找新的方向。
该研究取得延边大学附属医院伦理委员会的批准(No. 2020AP019)。患者在隐私被保护的前提下被告知:切除的标本由医院保存并有可能用于科学研究。本实验所用的鼻息肉组织均采集于2020 年5月~2021 年5 月招募的患有CRSwNP 的成年患者。以鼻中隔成形术矫正鼻中隔偏曲病人15 名为对照,取其钩突组织。
2.1 鼻息肉成纤维细胞原代培养 将取出的鼻息肉组织用灭菌加双抗PBS洗3次,然后将组织剪碎并使用消化液在37 ℃培养箱中孵育3 h,1 350 r/min 离心5 min 后弃上清液,余下细胞液置入10 cm 培养皿中并加入10 mL RPMI-1640培养液,最后将培养皿置入37 ℃、5%CO2培养箱中孵育。
2.2 人鼻黏膜上皮细胞(human nasal epithelial cells,HNEpCs)的培养 HNEpCs 购自丰晖生物(湖南),置于盛有RPMI-1640(Thermo)和10% FBS(Biowest)的培养皿,在37 ℃、5%CO2培养箱中培养,加入p38 MAPK 抑制剂 SB203580(SB)或 ERK1/2 抑制剂PD98059(PD),浓度均为1 μmol/L,处理12 h。
2.3 ELISA 根据ELISA 试剂盒说明书的步骤,检测患者钩突和鼻息肉组织中IL-17A 和MMP-9 的含量,并通过标准曲线计算其浓度。
2.4 RT-qPCR 通过Trizol 试剂(上海生工生物公司)从患者钩突和鼻息肉组织中提取总RNA。使用Quant cDNA合成试剂盒(北京天根生物技术公司)合成cDNA。使用SYBR Green 实时PCR 检测系统和特异性引物序列测定细胞因子IL-17及MMP-9的水平。采用 2-ΔΔCt法[12]计算相对基因表达量。
2.5 免疫组织化学染色 对烤好的片子进行脱蜡、脱水,再予以抗体修复液中修复0.5 h,然后用抗IL-17A 和MMP-9 的Ⅰ抗和相对应的Ⅱ抗进行孵育。DAB 显色、苏木精复染并封片。并于显微镜下观察,Cytantion5微孔成像仪进行拍片。
2.6 HE 染色 取出患者钩突和鼻息肉组织固定好,包埋后进行贴片、烤片、脱蜡、水洗、脱水后予以苏木素和伊红染色,再次脱水后封片,并于显微镜下观察,Cytantion5微孔成像仪进行拍片。
2.7 Western blot 将组织蛋白裂解或细胞蛋白收集后测定其样品蛋白浓度。配好的电泳胶上每个泳道加等量的蛋白开始电泳。将分离后的蛋白转到PVDF 膜上,封闭后加入稀释的Ⅰ抗(MMP-9、p-ERK1/2、p-JNK、p-p38和β-actin)4 ℃过夜。洗膜,相应Ⅱ抗再孵育2 h。再次洗膜后加入发光剂,利用AI 600凝胶成像仪采集图像。
2.8 细胞免疫荧光染色 将细胞以1×105均匀铺于6 孔板中,予以50 μg/L IL-17A 处理后,用4%多聚甲醛固定,用1%牛血清白蛋白(albumin)封闭30 min,然后首先用抗MMP-9 抗体在4 ℃下染色过夜。随后,将HNEpCs 与AlexaFluor 488 偶联的Ⅱ抗在室温下孵育2 h。最后,染DAPI并在显微镜下观察拍照。
2.9 明胶酶谱实验 将组织裂解后离心取上清液,提取总蛋白并测定蛋白含量,按照MMP-9 明胶酶谱试剂盒进行操作,蛋白上样后进行SDS-PAGE 分离,电泳结束后将凝胶置于洗脱液中洗去SDS,常温下孵育过夜,再经考马斯亮蓝染色、脱色,最后凝胶成像。
使用GraphPad Prism 9.1.2 进行数据分析与作图,所有数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示,两组间对比使用t检验,多组间比较使用方差分析和Bonferroni 校正的t检验,以P<0.05 为差异具有统计学意义。
从CRSwNP 患者和对照组受试者中获得相应组织,并采用ELISA以及RT-PCR方法对IL-17A的表达水平进行分析。从图1A 中我们可以看出,与对照组相比,CRSsNP 患者的IL-17A 表达水平呈上升趋势(P<0.01)。同样在CRSsNP 患者的鼻息肉组织中也发现IL-17A 的mRNA 较对照组表达上调(P<0.01),见图1B。与ELISA 和RT-qPCR 的研究结果一致,免疫组织化学染色显示,与对照组相比,CRswNP 患者中IL-17A 阳性表达在鼻息肉组织中明显增加,见图1C。
Figure 1. The expression of Il-17A in control patients and CRSwNP patients. A:the concentration of IL-17A in tissue supernatant was determined by ELISA;B:the mRNA expression of IL-17A was detected by RTPCR;C:immunohistochemical staining results of IL-17A in different groups(×200). Mean±SD. n=15.**P<0.01 vs control group.图1 对照组患者和CRSwNP患者中IL-17A的表达
用ELISA 法和RT-qPCR 法检测不同患者对应组织中MMP-9 的表达,结果表明,与对照组相比,CRSwNP 患者鼻息肉组织中MMP-9浓度及MMP-9的mRNA 表达明显升高(P<0.01),见图2A、B。明胶酶谱实验结果可见,与对照组相比,CRSwNP 患者MMP-9 活性也明显升高,见图2C。我们在CRSwNP患者鼻息肉及对照组患者钩突组织HE 染色中发现CRSwNP 较对照组炎症细胞表达明显增多,见图2D。同时,我们还在两组患者的组织化学染色中发现CRSwNP 患者较对照组患者的MMP-9 表达显著增加,见图2E。
Figure 2. Expression of MMP-9 in control and CRSwNP patients. A:the concentration of MMP-9 in tissue supernatant was measured by ELISA;B:the mRNA expression of MMP-9 was detected by RT-qPCR;C:the activity of MMP-9 in different groups;D:HE staining was used to observe the infiltration of inflammatory cells in different groups(×200);E:immunohistochemical staining results of MMP-9(×200). Mean±SD. n=15.**P<0.01 vs control group.图2 对照组患者和CRSwNP患者中MMP-9的表达
通过Western blot 检测了对照组钩突和CRSwNP患者鼻息肉中ERK1/2、JNK 和p38 的磷酸化水平,结果显示,CRSwNP 患者鼻息肉中 ERK1/2 和 p38 的磷酸化水平较对照组均上调(P<0.05或P<0.01),见图3A。随后我们将鼻息肉组织进行原代细胞培养,在分离出的鼻息肉成纤维细胞中分别加入p38 MAPK的抑制剂SB(SB203580)及ERK1/2 的抑制剂PD(PD98059),处理 12 h 后用 Western blot 检测 MMP-9的表达水平,我们发现SB 或PD 处理后MMP-9 的表达明显降低(P<0.01),见图3B。
Figure 3. MAPK expression in control and CRSwNP patients.A:the phosphorylation of MAPK pathway in different groups was determined by Western blot;B:the expression of MMP-9 in nasal polyp fibroblasts treated with SB or PD. Mean±SD. n=15.**P<0.01 vs control group.图3 对照组患者和CRSwNP患者中MAPK的表达
为探索IL-17A 是否可以提高HNEpCs 中MMP-9的分泌。我们用 IL-17A(0~50 μg/L)处理 HNEpCs 24 h,然后采用Western blot 和免疫荧光检测MMP-9蛋白表达。结果与我们的预期相同,MMP-9 的蛋白表达在IL-17A 作用下均升高,同时我们还发现,50 μg/L或许是IL-17A的最佳浓度(P<0.01),见图4。
Figure 4. Expression of MMP-9 protein in IL-17A-treated HNEpCs. A:the expression of MMP-9 protein in HNEpCs treated with IL-17A was determined by Western blot;B:immunofluorescence staining was performed to detect MMP-9 protein. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs control group.图4 IL-17A处理的HNEpCs中MMP-9蛋白的表达
Western blot 结果显示,用 IL-17A 刺激 HNEpCs可诱导ERK1/2 和p38 的有效活化,见图5A。为了确定p38 MAPK/ERK 信号的激活是否有助于IL-17A 促进 MMP-9 的产生,HNEpCs 与 SB 或 PD 预孵育,然后进行IL-17A 刺激。结果显示,用SB 或PD 预孵育可减 弱 HNEpCs 中 IL-17A 促 进 的 MMP-9 表 达(P<0.01),见图5B。这表明p38 MAPK/ERK 信号参与了HNEpCs中IL-17A诱导的MMP-9生成。
慢性鼻窦炎是一种复杂的上气道疾病,与各种细胞、炎症介质和细胞因子有关。目前,CRSwNP 的发病机制尚不清楚,其在标准化治疗后的复发倾向仍是临床上无法攻克的难题。CRSwNP 影响生活质量,需要大量的医疗资源[13]。因此,为了进一步研究CRSwNP的发病机制,探索可能的治疗靶点具有重要的临床意义。
Figure 5. Expression of MAPK pathway-related proteins in IL-17A-treated HNEpCs. A:the phosphorylation of MAPK pathway in HNEpCs treated with IL-17A was determined by Western blot;B:the expression of MMP-9 protein in HNEpCs pretreated with SB or PD. Mean±SD. n=3.##P<0.01 vs control group;**P<0.01 vs IL-17A treatment alone.图5 IL-17A处理的HNEpCs中MAPK通路相关蛋白的表达
IL-17A,是IL-17 细胞因子家族中最重要的成员,其主要生物学效应是促进炎症反应[14]。我们的研究表明,通过 ELISA 和 RT-PCR 检测,CRSwNP 患者鼻粘膜中IL-17A的表达明显高于对照组,同时,我们通过免疫组化对两组患者的组织进行染色,免疫组织染色结果与ELISA 和RT-qPCR 一致,以上结果均表明IL-17A 参与了CRSwNP 的发病机制。CRSwNP 中组织重塑的主要因素之一是ECM 成分被蛋白水解酶降解,而MMP-9 的抑制不足或异常增高可能导致ECM 降解,从而形成息肉[4]。当前的研究中,我们通过发现CRSwNP 中的MMP-9 表达比对照组明显升高,以上结果表明MMP-9 可能是慢性鼻窦炎的重要治疗靶点。同时HE 染色结果中我们还发现CRSwNP 较对照组组织炎症浸润明显。作为MMPs抑制剂之一,强力霉素已被证明能有效降低鼻分泌物中MMP-9 的表达,最终缩小息肉的大小[15]。研究还表明,功能性内窥镜鼻窦手术(functional endoscopic sinus surgery,FESS)后MMP-9的高浓度与不良治疗结果有关,多西环素缓释鼻窦支架已被证明可有效降低鼻MMP-9的浓度,提高FESS后患者的治疗效果[16]。此外,MMP-9 与 IL-1、TNF-α、VEGF 关系密切,IL-1大量存在于炎性组织中,可诱导并与TNF-α 结合,引起 MMPs 家族产生,同时,TNF-α、IL-1 和MMP-9彼此之间相互作用、相互影响。而IL-17可以协同 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 等,促进炎症发生发展。因此,CRSwNP 中MMP-9 的上游调节因子十分值得研究。
P38MAPK/ERK 通路调控一系列细胞生物学行为,但该通路在CRS 中的作用仍然未知。因此我们检测了两组患者组织中的ERK1/2、JNK 及p38 磷酸化水平,结果发现CRSwNP 较对照组ERK1/2 和p38磷酸化增加。同时我们还培养了CRSwNP 鼻息肉成纤维原代细胞并分别使用ERK1/2 和p38 抑制剂处理,我们的结果表明,经抑制剂处理的鼻息肉成纤维细胞MMP-9表达明显降低。
此外,根据上述结果,我们推测IL-17A在CRS粘膜上皮中与MMP-9 共定位,为进一步探究鼻上皮细胞中重塑的机制。我们用IL-17A 处理HNEpCs 并检测MMP-9 的产生。正如预期的那样,IL-17A 刺激可促进 HNEpCs 中 MMP-9 的生成,其浓度以 50 μg/L 为宜。作为MAPK通路的一个亚类,p38和ERK信号通路也被一系列磷酸化事件激活,以响应细胞外刺激,然后传递细胞外信号,诱导细胞增殖、分化和存活。在我们目前的研究中,我们证明了IL-17A 可有效诱导HNEpCs中p38和ERK1/2的磷酸化以及MMP-9的表达。此外,有证据表明MAPK 信号通路可促进巨噬细胞、中性粒细胞、心肌细胞、成纤维细胞和膀胱癌细胞中MMP-9 的产生[17-18]。我们的结果同样发现在HNEpCs 中这种MMP-9 的过度表达可通过ERK1/2、p38 途径特异性抑制剂 SB203580 和 PD98059 消除。以上研究结果表明,HNEpCs 中由IL-17A 激活的MMP-9表达异常升高由p38/ERK信号介导。
总之,本研究的结果表明,CRSwNP 中的局部炎症环境可能会诱导IL-17A的表达。IL-17A通过激活鼻上皮细胞中的p38/ERK通路活化使MMP-9表达过度增加,阻滞p38/ERK 通路的活化可能会缓解鼻窦炎伴鼻息肉组织重塑。