IL-17A通过p38 MAPK/ERK1/2信号通路上调慢性鼻窦炎患者MMP-9的表达*

王重阳 ， 金海南 ， 刘思奇 ， 张雅琳 ， 宋艺兰 ， 延光海 △， 金永德 △

（1延边大学吉林省过敏性常见疾病免疫与靶向研究重点实验室，吉林延吉133002；2延边大学附属医院耳鼻喉科，吉林延吉133002；3延边大学医学院解剖教研室，吉林延吉133002）

慢性鼻窦炎（chronic rhinosinusitis，CRS）是最常见的慢性炎症性疾病之一，我国的患病率约为8%［1］，欧美国家的患病率更高，约为 10.9%～11.9%［2］。CRS 不仅严重影响患者的生活质量，同时也消耗了大量的医疗资源。CRS 目前分为有鼻息肉的CRS（CRS with nasal polyps，CRSwNP）和无鼻息肉的CRS（CRS without nasal polyps，CRSsNP）。CRSwNP 的主要特征是基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）水平升高及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）中显著水肿形成［3］。MMPs 构成锌和钙依赖性蛋白酶家族，在蛋白质降解中起关键作用。MMPs与其金属蛋白酶组织抑制物之间的不平衡可导致水肿形成，是CRSwNP 组织重塑的主要机制之一［4］。以往的研究表明，MMPs 可能是肿瘤的重要潜在治疗靶点［5］。目前，CRSwNP 的发病机制仍不清楚。因此，进一步研究CRSwNP 的病理机制，发现其潜在治疗靶点十分有必要。

白细胞介素17A（interleukin-17A，IL-17A）是一种主要由辅助性T 细胞17（T helper 17 cells，Th17 细胞）产生的促炎细胞因子，已被证明与各种慢性炎症和自身免疫疾病有关［6-7］。据报道，使用抗IL-17A 或IL-17 受体A（IL-17 receptor A，IL-17RA）抗体可抑制TRAF6/NF-κB 信号通路，从而缓解广州血管圆线虫诱导小鼠的嗜酸性脑膜炎［8］。Krueger 等［9］证实Secukinumab（一种选择性抑制IL-17A 的人类抗体）治疗减少了银屑病的面积和严重程度。然而，抗IL-17A治疗在CRSwNP中是否有效的研究尚未见报道。因此，本研究旨在探讨IL-17A 在CRSwNP 中的表达及其作用机制。

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信号通路是一种蛋白质-丝氨酸/苏氨酸激酶级联反应，包括激活效应激酶ERK1/2 的双特异性 MAPK 激酶 1/2（MAPK kinase 1/2，MEK1/2）。该通路参与多种核转录因子，包括细胞增殖、凋亡、分化、炎症反应和其他生物学过程［10］。此外，线粒体膜电位、线粒体氧化应激和线粒体能量代谢也受到 p38 MAPK/ERK 通路的调节［11］。MAPK由于其在不同细胞类型、特定时间点和特定微环境中的差异，在CRSwNP 组织重塑过程中的作用比较复杂，有待进一步阐明。此外，我们对IL-17A 和MAPK 在CRS 反应过程中的相关性知之甚少。因此，我们探讨IL-17A 是否通过p38 MAPK/ERK1/2 信号通路增加慢性鼻窦炎中MMP-9 的异常表达，以期为临床CRSwNP的治疗寻找新的方向。

材料和方法

1 临床标本的采集

该研究取得延边大学附属医院伦理委员会的批准（No. 2020AP019）。患者在隐私被保护的前提下被告知：切除的标本由医院保存并有可能用于科学研究。本实验所用的鼻息肉组织均采集于2020 年5月～2021 年5 月招募的患有CRSwNP 的成年患者。以鼻中隔成形术矫正鼻中隔偏曲病人15 名为对照，取其钩突组织。

2 方法

2.1 鼻息肉成纤维细胞原代培养 将取出的鼻息肉组织用灭菌加双抗PBS洗3次，然后将组织剪碎并使用消化液在37 ℃培养箱中孵育3 h，1 350 r/min 离心5 min 后弃上清液，余下细胞液置入10 cm 培养皿中并加入10 mL RPMI-1640培养液，最后将培养皿置入37 ℃、5%CO2培养箱中孵育。

2.2 人鼻黏膜上皮细胞（human nasal epithelial cells，HNEpCs）的培养 HNEpCs 购自丰晖生物（湖南），置于盛有RPMI-1640（Thermo）和10% FBS（Biowest）的培养皿，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养，加入p38 MAPK 抑制剂 SB203580（SB）或 ERK1/2 抑制剂PD98059（PD），浓度均为1 μmol/L，处理12 h。

2.3 ELISA 根据ELISA 试剂盒说明书的步骤，检测患者钩突和鼻息肉组织中IL-17A 和MMP-9 的含量，并通过标准曲线计算其浓度。

2.4 RT-qPCR 通过Trizol 试剂（上海生工生物公司）从患者钩突和鼻息肉组织中提取总RNA。使用Quant cDNA合成试剂盒（北京天根生物技术公司）合成cDNA。使用SYBR Green 实时PCR 检测系统和特异性引物序列测定细胞因子IL-17及MMP-9的水平。采用 2-ΔΔCt法［12］计算相对基因表达量。

2.5 免疫组织化学染色 对烤好的片子进行脱蜡、脱水，再予以抗体修复液中修复0.5 h，然后用抗IL-17A 和MMP-9 的Ⅰ抗和相对应的Ⅱ抗进行孵育。DAB 显色、苏木精复染并封片。并于显微镜下观察，Cytantion5微孔成像仪进行拍片。

2.6 HE 染色 取出患者钩突和鼻息肉组织固定好，包埋后进行贴片、烤片、脱蜡、水洗、脱水后予以苏木素和伊红染色，再次脱水后封片，并于显微镜下观察，Cytantion5微孔成像仪进行拍片。

2.7 Western blot 将组织蛋白裂解或细胞蛋白收集后测定其样品蛋白浓度。配好的电泳胶上每个泳道加等量的蛋白开始电泳。将分离后的蛋白转到PVDF 膜上，封闭后加入稀释的Ⅰ抗（MMP-9、p-ERK1/2、p-JNK、p-p38和β-actin）4 ℃过夜。洗膜，相应Ⅱ抗再孵育2 h。再次洗膜后加入发光剂，利用AI 600凝胶成像仪采集图像。

2.8 细胞免疫荧光染色 将细胞以1×105均匀铺于6 孔板中，予以50 μg/L IL-17A 处理后，用4%多聚甲醛固定，用1%牛血清白蛋白（albumin）封闭30 min，然后首先用抗MMP-9 抗体在4 ℃下染色过夜。随后，将HNEpCs 与AlexaFluor 488 偶联的Ⅱ抗在室温下孵育2 h。最后，染DAPI并在显微镜下观察拍照。

2.9 明胶酶谱实验 将组织裂解后离心取上清液，提取总蛋白并测定蛋白含量，按照MMP-9 明胶酶谱试剂盒进行操作，蛋白上样后进行SDS-PAGE 分离，电泳结束后将凝胶置于洗脱液中洗去SDS，常温下孵育过夜，再经考马斯亮蓝染色、脱色，最后凝胶成像。

3 统计学处理

使用GraphPad Prism 9.1.2 进行数据分析与作图，所有数据均采用均数±标准差（mean±SD）表示，两组间对比使用t检验，多组间比较使用方差分析和Bonferroni 校正的t检验，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

结 果

1 鼻窦炎患者IL-17A表达水平

从CRSwNP 患者和对照组受试者中获得相应组织，并采用ELISA以及RT-PCR方法对IL-17A的表达水平进行分析。从图1A 中我们可以看出，与对照组相比，CRSsNP 患者的IL-17A 表达水平呈上升趋势（P＜0.01）。同样在CRSsNP 患者的鼻息肉组织中也发现IL-17A 的mRNA 较对照组表达上调（P＜0.01），见图1B。与ELISA 和RT-qPCR 的研究结果一致，免疫组织化学染色显示，与对照组相比，CRswNP 患者中IL-17A 阳性表达在鼻息肉组织中明显增加，见图1C。

2 鼻窦炎患者MMP-9表达水平

Figure 1. The expression of Il-17A in control patients and CRSwNP patients. A：the concentration of IL-17A in tissue supernatant was determined by ELISA；B：the mRNA expression of IL-17A was detected by RTPCR；C：immunohistochemical staining results of IL-17A in different groups（×200）. Mean±SD. n=15.**P＜0.01 vs control group.图1 对照组患者和CRSwNP患者中IL-17A的表达

用ELISA 法和RT-qPCR 法检测不同患者对应组织中MMP-9 的表达，结果表明，与对照组相比，CRSwNP 患者鼻息肉组织中MMP-9浓度及MMP-9的mRNA 表达明显升高（P＜0.01），见图2A、B。明胶酶谱实验结果可见，与对照组相比，CRSwNP 患者MMP-9 活性也明显升高，见图2C。我们在CRSwNP患者鼻息肉及对照组患者钩突组织HE 染色中发现CRSwNP 较对照组炎症细胞表达明显增多，见图2D。同时，我们还在两组患者的组织化学染色中发现CRSwNP 患者较对照组患者的MMP-9 表达显著增加，见图2E。

3 鼻窦炎患者MAPK信号通路相关蛋白表达水平

Figure 2. Expression of MMP-9 in control and CRSwNP patients. A：the concentration of MMP-9 in tissue supernatant was measured by ELISA；B：the mRNA expression of MMP-9 was detected by RT-qPCR；C：the activity of MMP-9 in different groups；D：HE staining was used to observe the infiltration of inflammatory cells in different groups（×200）；E：immunohistochemical staining results of MMP-9（×200）. Mean±SD. n=15.**P＜0.01 vs control group.图2 对照组患者和CRSwNP患者中MMP-9的表达

通过Western blot 检测了对照组钩突和CRSwNP患者鼻息肉中ERK1/2、JNK 和p38 的磷酸化水平，结果显示，CRSwNP 患者鼻息肉中 ERK1/2 和 p38 的磷酸化水平较对照组均上调（P＜0.05或P＜0.01），见图3A。随后我们将鼻息肉组织进行原代细胞培养，在分离出的鼻息肉成纤维细胞中分别加入p38 MAPK的抑制剂SB（SB203580）及ERK1/2 的抑制剂PD（PD98059），处理 12 h 后用 Western blot 检测 MMP-9的表达水平，我们发现SB 或PD 处理后MMP-9 的表达明显降低（P＜0.01），见图3B。

Figure 3. MAPK expression in control and CRSwNP patients.A：the phosphorylation of MAPK pathway in different groups was determined by Western blot；B：the expression of MMP-9 in nasal polyp fibroblasts treated with SB or PD. Mean±SD. n=15.**P＜0.01 vs control group.图3 对照组患者和CRSwNP患者中MAPK的表达

4 IL-17A诱导HNEpCs中MMP-9蛋白的表达

为探索IL-17A 是否可以提高HNEpCs 中MMP-9的分泌。我们用 IL-17A（0～50 μg/L）处理 HNEpCs 24 h，然后采用Western blot 和免疫荧光检测MMP-9蛋白表达。结果与我们的预期相同，MMP-9 的蛋白表达在IL-17A 作用下均升高，同时我们还发现，50 μg/L或许是IL-17A的最佳浓度（P＜0.01），见图4。

Figure 4. Expression of MMP-9 protein in IL-17A-treated HNEpCs. A：the expression of MMP-9 protein in HNEpCs treated with IL-17A was determined by Western blot；B：immunofluorescence staining was performed to detect MMP-9 protein. Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图4 IL-17A处理的HNEpCs中MMP-9蛋白的表达

5 IL-17A通过p38 MAPK/ERK途径上调HNEpCs中MMP-9的表达

Western blot 结果显示，用 IL-17A 刺激 HNEpCs可诱导ERK1/2 和p38 的有效活化，见图5A。为了确定p38 MAPK/ERK 信号的激活是否有助于IL-17A 促进 MMP-9 的产生，HNEpCs 与 SB 或 PD 预孵育，然后进行IL-17A 刺激。结果显示，用SB 或PD 预孵育可减 弱 HNEpCs 中 IL-17A 促 进 的 MMP-9 表 达（P＜0.01），见图5B。这表明p38 MAPK/ERK 信号参与了HNEpCs中IL-17A诱导的MMP-9生成。

讨 论

慢性鼻窦炎是一种复杂的上气道疾病，与各种细胞、炎症介质和细胞因子有关。目前，CRSwNP 的发病机制尚不清楚，其在标准化治疗后的复发倾向仍是临床上无法攻克的难题。CRSwNP 影响生活质量，需要大量的医疗资源［13］。因此，为了进一步研究CRSwNP的发病机制，探索可能的治疗靶点具有重要的临床意义。

Figure 5. Expression of MAPK pathway-related proteins in IL-17A-treated HNEpCs. A：the phosphorylation of MAPK pathway in HNEpCs treated with IL-17A was determined by Western blot；B：the expression of MMP-9 protein in HNEpCs pretreated with SB or PD. Mean±SD. n=3.##P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs IL-17A treatment alone.图5 IL-17A处理的HNEpCs中MAPK通路相关蛋白的表达

IL-17A，是IL-17 细胞因子家族中最重要的成员，其主要生物学效应是促进炎症反应［14］。我们的研究表明，通过 ELISA 和 RT-PCR 检测，CRSwNP 患者鼻粘膜中IL-17A的表达明显高于对照组，同时，我们通过免疫组化对两组患者的组织进行染色，免疫组织染色结果与ELISA 和RT-qPCR 一致，以上结果均表明IL-17A 参与了CRSwNP 的发病机制。CRSwNP 中组织重塑的主要因素之一是ECM 成分被蛋白水解酶降解，而MMP-9 的抑制不足或异常增高可能导致ECM 降解，从而形成息肉［4］。当前的研究中，我们通过发现CRSwNP 中的MMP-9 表达比对照组明显升高，以上结果表明MMP-9 可能是慢性鼻窦炎的重要治疗靶点。同时HE 染色结果中我们还发现CRSwNP 较对照组组织炎症浸润明显。作为MMPs抑制剂之一，强力霉素已被证明能有效降低鼻分泌物中MMP-9 的表达，最终缩小息肉的大小［15］。研究还表明，功能性内窥镜鼻窦手术（functional endoscopic sinus surgery，FESS）后MMP-9的高浓度与不良治疗结果有关，多西环素缓释鼻窦支架已被证明可有效降低鼻MMP-9的浓度，提高FESS后患者的治疗效果［16］。此外，MMP-9 与 IL-1、TNF-α、VEGF 关系密切，IL-1大量存在于炎性组织中，可诱导并与TNF-α 结合，引起 MMPs 家族产生，同时，TNF-α、IL-1 和MMP-9彼此之间相互作用、相互影响。而IL-17可以协同 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 等，促进炎症发生发展。因此，CRSwNP 中MMP-9 的上游调节因子十分值得研究。

P38MAPK/ERK 通路调控一系列细胞生物学行为，但该通路在CRS 中的作用仍然未知。因此我们检测了两组患者组织中的ERK1/2、JNK 及p38 磷酸化水平，结果发现CRSwNP 较对照组ERK1/2 和p38磷酸化增加。同时我们还培养了CRSwNP 鼻息肉成纤维原代细胞并分别使用ERK1/2 和p38 抑制剂处理，我们的结果表明，经抑制剂处理的鼻息肉成纤维细胞MMP-9表达明显降低。

此外，根据上述结果，我们推测IL-17A在CRS粘膜上皮中与MMP-9 共定位，为进一步探究鼻上皮细胞中重塑的机制。我们用IL-17A 处理HNEpCs 并检测MMP-9 的产生。正如预期的那样，IL-17A 刺激可促进 HNEpCs 中 MMP-9 的生成，其浓度以 50 μg/L 为宜。作为MAPK通路的一个亚类，p38和ERK信号通路也被一系列磷酸化事件激活，以响应细胞外刺激，然后传递细胞外信号，诱导细胞增殖、分化和存活。在我们目前的研究中，我们证明了IL-17A 可有效诱导HNEpCs中p38和ERK1/2的磷酸化以及MMP-9的表达。此外，有证据表明MAPK 信号通路可促进巨噬细胞、中性粒细胞、心肌细胞、成纤维细胞和膀胱癌细胞中MMP-9 的产生［17-18］。我们的结果同样发现在HNEpCs 中这种MMP-9 的过度表达可通过ERK1/2、p38 途径特异性抑制剂 SB203580 和 PD98059 消除。以上研究结果表明，HNEpCs 中由IL-17A 激活的MMP-9表达异常升高由p38/ERK信号介导。

总之，本研究的结果表明，CRSwNP 中的局部炎症环境可能会诱导IL-17A的表达。IL-17A通过激活鼻上皮细胞中的p38/ERK通路活化使MMP-9表达过度增加，阻滞p38/ERK 通路的活化可能会缓解鼻窦炎伴鼻息肉组织重塑。