醒脑开窍针刺法通过调控mTOR-EAAT2通路影响脑卒中后痉挛大鼠大脑皮层神经递质代谢*

庞青民， 赵欲晓， 邵素菊， 李鸿章， 王承惠△

（1郑州大学附属郑州中心医院针灸理疗科，河南郑州450000；2河南邵氏针灸流派传承工作室，河南郑州450008；3河南省中医院康复科，河南郑州450002）

脑卒中中90%患者出现偏瘫性肢体痉挛，属最常见的肢体功能障碍，因痉挛导致脑卒中不能独立生活的患者达70%～80%，且常规步态康复很难使患者恢复如初［1］，严重影响患者生活质量。目前西药治疗脑卒中后痉挛的主要方法是改变神经递质含量和功能，虽能改善痉挛状态，但却不能恢复肌张力，效果不明显［2］。中医认为脑络淤阻是脑卒中后痉挛的主要原因，而针灸可调整营卫气血，使阴阳平衡，脏腑调和［3］。醒脑开窍针刺法作为治疗脑卒中后痉挛针刺方法之一，具有醒脑开窍、疏经通络、滋肝补肾等作用，可促进大脑生理功能逐渐恢复，可改善元神之府、开窍启闭［4］，是治疗脑卒中后痉挛的可靠方法，且效果明显，但其作用机制尚需进一步研究。

已知兴奋性氨基酸转运体2（excitatory amino acid transporter 2，EAAT2）长期损伤会促进中枢神经系统紊乱，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）可介导调控EAAT2，从而影响神经递质功能［5-6］，推测醒脑开窍针刺法可能调控mTOR-EAAT2通路发挥作用。因此，本研究建立脑卒中后痉挛大鼠模型，用醒脑开窍针刺法治疗后观察对神经递质的影响，初步探讨其机制，以期为临床上醒脑开窍针刺法治疗脑卒中后痉挛提供参考依据。

材料和方法

1 实验材料

1.1 实验动物 健康 SPF 级 SD 大鼠，8 周龄，体重（220±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK（京）2016-0011。动物实验中心的温度为（24±1）℃、湿度（60±5）%、12 h/12 h（光照/黑暗），室内通风良好，定期更换垫料，暂养1周进行实验。本实验经本院伦理协会审核并通过。

1.2 试剂 mTOR 抑制剂雷帕霉素（Gene Operation）；N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受体（北京百灵威科技有限公司）；γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、天门冬氨酸（D-aspartic acid，Asp）、谷氨酸（glutamic acid，Glu）和甘氨酸（glycine，Gly）储备液（Sigma）；邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA；济南泛诺化工有限公司）；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 仪器 脑立体定位仪（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，型号69100）；高效液相色谱仪（Aupos Scientific，型号 APS-8036）；实时荧光定量 PCR（realtime quantitative PCR，RT-qPCR）仪（赛默飞世尔，型号7500）；蛋白凝胶成像系统（上海天能科技有限公司，型号Tanon3500）。

2 实验方法

2.1 动物模型的建立 参考文献［7］采用改良的大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）线栓法+内囊注射NMDA 受体法制作脑卒中后痉挛模型。大鼠麻醉后，沿颈部正中偏右切口、暴露出右侧颈总动脉和迷走神经并钝性分离，再依次向上暴露颈总动脉分叉、颈内动脉与颈外动脉，分别结扎颈总动脉远心端，颈内动脉、颈外动脉近心端，动脉夹夹闭右侧颈内动脉；离颈总动脉分叉膨大5 mm 处剪一小切口，栓线经切口插入颈内动脉，稍感阻力停止插线（深度18～20 mm），松开动脉夹，颈内动脉近心端和栓线一起结扎，缝合切口。大鼠清醒后Zea Longa 评分为1～3 分的大鼠第2 天行内囊注射NMDA 受体法［8］。大鼠俯卧固定大鼠脑立体定位仪上，沿颅顶矢状缝作纵行切口，暴露右侧顶骨和额骨交界骨缝，按《大鼠立体定位图谱》确定内囊位置，前囟后1.4 mm、矢状缝右侧2.4 mm，牙科钻钻直径约2 mm 小孔，微量注射器垂直插入7 mm 缓慢注射5 μL NMDA 受体，注射速度 1 μL/min，注射完毕后拔出微量注射器，止血消毒、逐层缝合切口。大鼠苏醒后，将 Ashworth 肌张力评分≥1 分，Zea Longa 评分 1～3分视为模型建立成功。术后均注射青霉素、速尿以抗感染、防脑水肿；术后正常单笼饲养。

2.2 实验设计与分组 实验分为假手术（sham operation）组、模型（model）组、针刺（acupuncture）组、非穴位（non acupoint）组和针刺+抑制剂（acupuncture tinhibitor）组，每组10 只大鼠。假手术组仅暴露出右侧颈总动脉和迷走神经后缝合，除假手术组外其余各组建立脑卒中后痉挛模型。造模后，假手术组和模型组不进行任何干预；针刺组参照郭义主编《实验针灸学实验指导》［9］，并根据华兴邦等［10］研究的大鼠穴位图谱进行大鼠穴位定位，利用醒脑开窍针刺法［11］进行针刺处理。简言之，首先选取穴位为双侧“内关”、“水沟”和“内关”穴在大鼠前肢内侧距腕横纹上3～4 mm 尺桡骨缝间，直刺进针捻转提泻法1 min，留针30 min，并利用电针仪刺激，电针刺激强度为3 mA，频率2 Hz；继续刺“水沟”穴，“水沟”穴在大鼠鼻中隔下部，向上斜刺入3 mm，施雀啄手法刺激10 次，每次 30 min，刺激强度为 3 mA，频率 2 Hz，每天1 次，连续5 d；非穴位组在大鼠双胁下非穴位处（共2 处）做相同处理；针刺+抑制剂组在针刺组基础上腹腔注射2 mg·kg-1·d-1雷帕霉素。

2.3 神经功能的检测指标与方法 （1）神经功能评分：Zea Longa 评分法评价造模后和实验结束后大鼠神经损伤程度。无神经损伤症状，活动正常-0 分；不能完全伸展对侧前爪，轻微神经损伤-1 分；爬行时偏瘫侧旋转，重度神经损伤-2 分；行走时对侧倾倒，重度神经损伤-3 分；不能自发行走，意识下降甚至丧失-4 分，死亡-5 分。（2）肌张力评分：改良 Ashworth 肌张力评分评价造模后和实验结束后大鼠肌张力程度。大鼠活动自如，无肌张力增高-0 级（0 分）；抓握中被动屈伸至最后有小的阻力，肌张力轻度增加-1级（1分）；抓握至一半关节活动度以上有轻度阻力增加，肌张力轻度增加-1+级（1.5分）；肌张力在大部分关节活动度中都有较大增加，但肢体被动运动容易-2 级（2 分）；被动活动困难，肌张力明显增高-3 级（3分）；强直性屈曲或伸直，受累部分肢体-4级（4分）。

2.4 OPA 柱前衍生高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）荧光法测定大脑皮层GABA、Gly、Glu 和 Asp 的含量 大鼠肌张力检测后迅速断头，冰上快速操作取脑，部分置于-80 ℃冰箱保存，部分大脑皮层组织按1∶9 添加生理盐水，冰上手动匀浆，3 000 r/min 4 ℃离心20 min，取上清0.5 mL 添加1 mL 高氯酸（0.4 mol/L）、50 μL 混合标准贮备液3 000 r/min 4℃离心15 min，取上清液0.5 μL 添加1 mL 碳酸钾缓冲溶液（2 mol/L）、5 mL 碳酸钾缓冲溶液（0.1 mol/L）10 000 r/min 4 ℃离心20 min，取上清液按衍生化反应和色谱条件洗脱。同时配制GABA、Gly、Glu 和Asp 对照贮备液，高效液相色谱仪以流动相磷酸二氢钾缓冲液（0.1 mol/L、pH6.0）∶甲醇∶乙腈（6∶3∶1），0.45 μm 孔径滤膜过滤，脱气15 min，流速1.0 mL/min，荧光检测发射波长455 nm、激发波长357 nm。各氨基酸同内标的峰面积比值和各自浓度作标准曲线，测定待测氨基酸与内标峰面积比值，求出待测样品中氨基酸浓度。

2.5 RT-qPCR 检 测 大 脑 皮 层 mTOR 和 EAAT2 的mRNA 水平 -80 ℃冰箱中取部分大脑皮层组织，Trizol 法提取总RNA，cDNA 第1 条链试剂盒合成cDNA，RT-qPCR 法检测大脑皮层中 mTOR 和 EAAT2 的mRNA 水平。mTOR 的上游引物序列为5’-CTGGGACTCAAATGTGTGCAGTTC-3’，下游引物序列为 5’ -GAACAATAGGGTGAATGATCCGGG-3’ ；EAAT2 的上游引物序列为5’-ATGCTCCTCATTCTCACAG-3’，下游引物序列为 5’-CTACATTGACCGAAGTTCTC-3’；β-actin 的上游引物：序列为 5’-GCTGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游引物序列为 5’-GGAGGAAGAGGATGCGGCAGTGG-3’。20 μL 反 应 体 系 为 50 μg/L cDNA 1 μL、2×Hi SYBR Green QPCR Mix 10 μL、上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL、ddH2O 8.0 μL。反应条件为 94 ℃、90 s、95 ℃32 s（mTOR：60 ℃、35 s、EAAT2：61℃、40 s），40个 循 环 。 2-ΔΔCT法 计 算 大 脑 皮 层 mTOR、EAAT2 的mRNA表达水平。

2.6 Western blot 检测大脑皮层 mTOR 和 EAAT2 的蛋白水平 -80 ℃冰箱中取部分大脑皮层组织，蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，凝胶电泳分离蛋白、PVDF 膜转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，PBST 清洗 3 次，分别加入对应的 抗 mTOR、EAAT2 和 β-actin 抗体，4 ℃过夜孵育；PBST 清洗 3次，时间分别为5 min、10 min 和20 min；加入对应Ⅱ抗，室温孵育1 h，显色、蛋白凝胶成像系统拍照、ImageJ 定量分析灰度值。目的蛋白水平相对值=目的蛋白灰度值/对应内参蛋白灰度值。

3 统计学处理

用统计学软件SPSS 25.0 进行数据分析。偏态数据以中位数（median，M）及四分位数间距（quartile range，QR）［M（QR）］表示，两组间比较采用 Mann-Whitney U 检验，多组间比较采用 Kruskai-Wallis H 检验；正态数据以均数±标准差（mean±SD）描述，多组间比较用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 醒脑开窍针刺法对大鼠神经功能评分和肌张力评分的影响

造模后，与假手术组相比，模型组、针刺组、非穴位组和针刺+抑制剂组神经功能评分和肌张力评分升高（P＜0.05）。实验结束后，与假手术组相比，模型组、针刺组、非穴位组和针刺+抑制剂组神经功能评分和肌张力评分升高（P＜0.05）；与模型组相比，针刺组神经功能评分和肌张力评分及针刺+抑制剂组肌张力评分降低（P＜0.05）；与针刺组相比，非穴位组和针刺+抑制剂组神经功能评分和肌张力评分升高（P＜0.05）；与非穴位组相比，针刺+抑制剂组肌张力评分降低（P＜0.05）。与造模后相比，实验结束后针刺组神经功能评分、肌张力评分，针刺+抑制剂组肌张力评分降低（P＜0.05）。见表1。

表1 5组大鼠神经功能评分和肌张力评分比较Table 1. Comparison of neurological function score and muscle tension score of the rats in the 5 groups［Median（QR）. n=10］

2 醒脑开窍针刺法对大鼠大脑皮层GABA、Gly、Glu和Asp含量的影响

与假手术组相比，模型组、非穴位组和针刺+抑制剂组大脑皮层GABA 和Gly 含量降低，Glu 和Asp含量升高（P＜0.05），针刺组大脑皮层Gly 含量降低（P＜0.05）；与模型组相比，针刺组大脑皮层GABA 和Gly 含量升高，Glu 和Asp 含量降低（P＜0.05），针刺+抑制剂组大脑皮层GABA 含量升高，Glu 和Asp 含量降低（P＜0.05）；与针刺组相比，非穴位组和针刺+抑制剂组大脑皮层GABA 和Gly 含量降低，Glu 和Asp含量升高（P＜0.05）；与非穴位组相比，针刺+抑制剂组大脑皮层 GABA 和 Gly 含量升高，Glu、Asp 含量降低（P＜0.05）。见表2。

表2 5组大鼠大脑皮层GABA、Gly、Glu和Asp含量的比较Table 2. Comparison of the contents of GABA，Gly，Glu and Asp in cerebral cortex of the rats in the 5 groups（μmol/L. Mean±SD. n=10）

3 醒脑开窍针刺法对大鼠大脑皮层mTOR 和EAAT2 mRNA和蛋白水平的影响

与假手术组相比，模型组、非穴位组和针刺+抑制剂组大脑皮层mTOR 和EAAT2的mRNA 水平及针刺组大脑皮层mTOR 的mRNA 水平降低（P＜0.05）；与模型组相比，针刺组和针刺+抑制剂组大脑皮层mTOR 和 EAAT2 的 mRNA 水平升高（P＜0.05）；与针刺组相比，非穴位组和针刺+抑制剂组大脑皮层mTOR 和 EAAT2 的 mRNA 水平降低（P＜0.05）；与非穴位组相比，针刺+抑制剂组大脑皮层mTOR、EAAT2的mRNA水平升高（P＜0.05）。见图1。

与假手术组相比，模型组、针刺组、非穴位组和针刺+抑制剂组大脑皮层mTOR 和EAAT2 的蛋白水平降低（P＜0.05）；与模型组相比，针刺组大脑皮层mTOR、EAAT2 的蛋白水平，针刺+抑制剂组大脑皮层EAAT2 的蛋白水平升高（P＜0.05）；与针刺组相比，非穴位组和针刺+抑制剂组大脑皮层mTOR、EAAT2 的蛋白水平降低（P＜0.05）；与非穴位组相比，针刺+抑制剂组大脑皮层EAAT2 的蛋白水平升高（P＜0.05）。见图1。

Figure 1. Relative mRNA and protein levels of mTOR and EAAT2 in cerebral cortex of the rats in the 5 groups. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs sham operation group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs acupuncture group；&P＜0.05 vs non-acupoint group.图1 5组大鼠大脑皮层mTOR和EAAT2蛋白和mRNA水平的比较

讨 论

本研究发现神经功能评分、肌张力评分在造模后模型组、针刺组、非穴位组、针刺+抑制剂组均出现升高现象，提示脑卒中后痉挛模型制作成功。醒脑开窍针刺法治疗后神经功能评分、肌张力评分均有所下降，提示醒脑开窍针刺法可缓解脑卒中后痉挛现象，实现对大鼠的保护，但机制尚需进一步研究。脑卒中后痉挛会诱发神经递质功能异常，特别是氨基酸类神经递质失常。氨基酸类神经递质分为兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸，抑制性氨基酸包括GABA和Gly等，兴奋性氨基酸包括Glu和Asp等，抑制性神经递质相对降低或兴奋性神经递质相对增加均会加剧痉挛［12］。GABA作为抑制性神经递质代表，由兴奋性神经递质Glu 在Glu 脱羧酶作用下脱去羧基而成，可与GABA 受体结合，从而抑制钙离子流入前突触，抑制兴奋性神经递质，进而缓解痉挛［13］。Gly 属突触后抑制，若Gly 受到拮抗则会引起强烈的痉挛反应［14］。Glu 属哺乳动物中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质，过度刺激Glu 会造成神经中毒，可参与包括脑卒中、阿尔茨海默症、癫痫症、帕金森综合征和抑郁症等多种神经系统疾病的发病机制［15］。正常情况下，末梢去极化后，存在于末梢突触囊泡中的Glu 和Asp 释放到突触间隙，与突触后膜特异性受体结合发挥生理效应，可产生兴奋性突触后膜；若脑损伤，主要表现为钠离子内流，导致脑部能量供应不足，Glu 和Asp 释放到突触间隙后，重新摄入受到抑制，在细胞外大量堆积，造成细胞毒性［16］。在本研究中，醒脑开窍针刺法治疗后大鼠大脑皮层GABA 和Gly 含量升高，Glu 和Asp 含量降低，提示醒脑开窍针刺法不仅能够抑制兴奋性神经递质的表达，促进兴奋性神经递质进入细胞中，而且促进抑制性神经递质释放，进而抑制兴奋性神经递质，缓解痉挛。

EAAT2 主要在星形胶质细胞中表达，少量在神经元和少突胶质细胞中，含有八个跨膜结构域和一个具有调节作用的3’-UTR 区，在啮齿动物中又称Glu 转运体1，作为钠离子依赖的Glu 转运蛋白，主要负责摄取突触间隙中Glu 进而清除，维持细胞外Glu稳定，降低突触中Glu在突触间隙的积累造成的神经元兴奋毒性作用［17］。而mTOR 水平的改变影响EAAT2 的水平与功能［18］。mTOR 作为能量代谢相关经典通路，是机体能量感知的关键分子，广泛存在于中枢神经系统中，在下丘脑、海马、大脑皮层中广泛表达，与机体的能量状态关系密切，参与突触可塑性、神经递质受体、离子通道、轴突芽生等多种分子过程［19］。在本研究中，与假手术组相比，模型组大鼠大脑皮层中mTOR 和EAAT2的mRNA 和蛋白水平下降，提示 mTOR 表达下降导致 mTOR 对 EAAT2 的作用降低，EAAT2 清除Glu 功能减弱，促进神经元毒性。针刺组脑卒中后痉挛大鼠大脑皮层中mTOR 和EAAT2 mRNA 和蛋白表达水平上升，提示经醒脑开窍针刺法治疗后可减轻大脑皮层mTOR 下降情况，增加清除Glu 功能，促进神经元毒性的分解，从而实现对疾病的缓解。而在醒脑开窍针刺法基础上添加mTOR 抑制剂雷帕霉素后，mTOR、EAAT2 的 mRNA和蛋白表达水平下降，GABA 和 Gly 含量下降，Glu 和Asp 含量升高，提示mTOR 抑制剂能够逆转醒脑开窍针刺法，加重疾病，醒脑开窍针刺法能够激活mTOREAAT2 通路降低 Glu 和 Asp 含量，升高 GABA 和 Gly含量，降低突触间隙造成的神经元兴奋毒性积累过程，实现对脑卒中后痉挛的缓解。

综上所述，醒脑开窍针刺法可通过激活mTOREAAT2 通路调控脑卒中后痉挛大鼠神经递质，实现对疾病的缓解，为临床上醒脑开窍针刺法治疗脑卒中后痉挛提供一定理论依据，且本文首次发现mTOR-EAAT2 通路对 Asp、GABA 和 Gly 含量亦有调控作用，但属直接还是间接调控需进一步研究。