抑制DNMT3A促进E2F1诱导间充质干细胞向动脉内皮细胞分化及血管生成*

苏凯悦， 车丽娜， 李凤娇， 段晓昶， 李 栋， 何红鹏， 张同存， 王 楠△

（1天津科技大学生物工程学院，天津300457；2山东大学齐鲁医院低温医学研究室，山东济南250000）

血管内皮损伤见于动脉粥样硬化、高血压和糖尿病血管病变等多种心脑血管疾病，被认为是这些疾病的始动环节，因此人们努力探索损伤内皮的因素及机制，以及研究受损内皮分泌的活性物质（有害的或/和有益的）变化在疾病中的作用及机制［1］。然而血管内皮细胞损伤修复的机制尚未完全明了。内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是归巢于血管新生组织并能分化增殖为成熟内皮细胞的干细胞，在内皮修复以及血管新生中具有重要作用［2］。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在体内外具有向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等组织及内皮细胞分化的潜能，是治疗血管生成的理想候选细胞。文献中证实出生后的血管新生与内皮损伤后修复过程主要由骨髓中的EPCs 来完成，在正常的情况下，骨髓中的细胞（主要是EPCs，也包括MSCs）处于休眠状态，在众多刺激因素作用下激活体循环，并迁移到特定的位点进行分化和增生，形成内皮细胞并促进血管损伤修复与生成［3］。当内皮受损时，骨髓MSC/EPC 被动员进入外周血并进一步迁移到损伤组织［4］。MSCs 通过多种机制参与成体血管新生。MSCs 可以通过免疫调节促进血管生成，也能直接分泌血管生成因子，例如 VEGF 和 FGF2 等［5］，这些因子能影响血管内皮细胞存活、增殖和迁移并调节血管形成。另外MSCs 还可以分泌具有调节血管生成活性的微囊泡和外泌体［6］。蛋白质组学结果也证实了人MSCs外泌体包含许多与血管生成相关的蛋白质，当MSCs 暴露于缺血部位时，这些蛋白质表达会上调［7］并促进血管生成。

目前已知间充质干细胞向血管内皮细胞分化可由许多刺激触发，如生长因子、支架性质和机械应力等。2007 年，Pasquinelli 等［8］从胸主动脉中膜与外膜交界处分离出了表达间充质细胞标志CD44、CD90和CD105 的祖细胞，这些细胞可在体外分化为ECs。而大量研究已经证实骨髓或其他来源的MSCs 可以在体外和体内分化为内皮细胞，有助于新血管的形成［9-13］。我们前期也证实抑制DNA 甲基化有助于MSCs向动脉内皮细胞分化［14］。

细胞周期相关转录因子E2F1（E2F transcription factor 1）是细胞周期相关转录因子E2F 家族成员之一，在全身多种肿瘤组织和细胞中呈高表达，起着促癌基因的作用。E2F 转录因子调控多种细胞过程，许多参与血管生成的基因启动子中都有潜在的E2F1 结合位点，E2F1 可与这些启动子结合，血管内皮 生 长 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）刺激后E2F1 的募集增强，伴随Rb 的解离，导致这些启动子的转录激活，这些启动子被E2F1 诱导并被 Rb 抑制，而 E2F1 的缺失降低了它们的表达［15］。E2F1/SNHG7/miR-186-5p/MMP2 信号通路在内皮细胞增殖和迁移中的重要作用［16］。我们之前的研究结果证实在间充质干细胞向内皮细胞分化过程中E2F1 水平升高，并介导人骨髓间充质干细胞中ephrin-B2 和 HEY2 的转录调节［14］，但 E2F1 过表达是否有助于间充质干细胞向内皮细胞分化、抑制DNA 甲基转移酶DNMT3A 是否能促进E2F1 诱导的MSCs 向内皮细胞分化，这些目前尚不清楚。本课题探究在诱导人脐带间充质干细胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，hUCMSCs）向内皮细胞分化的过程中，敲减DNMT3A同时过表达E2F1 在体内和体外对间充质干细胞血管形成的作用，从而为血管组织工程与干细胞疗法提供新的依据。

材料和方法

1 动物

SPF 级 BALB/c 裸鼠，均为雌性，4～6 周龄，15～17 g，由山东斯克贝斯生物科技股份有限公司提供，许可证号为SCXK（鲁）2016-0001。

2 主要试剂

DMEM/F12 培养基购自Gibco；胎牛血清购自AusGeneX；抗 CD44-APC、CD90-FITC 和 CD34-PE 抗体购自BioLegend；抗CD45-PerCP 抗体购自BD；内皮诱导分化培养基购自Lonza；pCMV-HA-E2F1 过表达质粒购自Addgene；转染试剂TurboFect Transfection Reagent 购自 Thermo；鼠抗 E2F1、DNMT3A 和 ephrin-B2 多克隆抗体购自Santa Cruz；兔抗HEY2 多克隆抗体购自北京博奥森公司；IRDye-800-conjugated antimouse 和 IRDye-680-conjugated anti-rabbit 购 自 LICOR Biosciences；Matrigel 购自 BD Biosciences；Trizol购自 Invitrogen；M-MLV 逆转录酶购自 Promega；Bestar SYBR Green qPCR Master Mix 购自DBI Bioscience；其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。所用引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司根据设计合成。

3 主要方法

3.1 hUCMSCs 的表面标记检测 hUCMSCs 由本实验室保存［14］，在含10%胎牛血清、100 mg/L 链霉素和100 IU/mL 青霉素的DMEM/F12 培养基中培养。收集第3 代hUCMSCs，待细胞长到80%～90%融合后，0.25%胰酶消化并离心收集细胞，加入1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞，并调整细胞密度为1×109/L，将细胞悬液转移至流式管，每个流式管加入100 μL细胞悬液。分别加入抗CD44-APC、CD90-FITC、CD34-PE 和CD45-PerCP 抗体充分振荡细胞悬液，避光 4 ℃孵育 30 min 后，1 000 r/min 离心 5 min，弃上清。加入200 μL PBS 缓冲液，吹打混匀后1 000 r/min 离心5 min，弃上清，重复1 次，洗去细胞悬液中未结合的抗体。每管加入200 μL PBS，轻吹重悬细胞液。经流式细胞仪（BD）检测，采用FlowJo-V10.7软件分析结果。

3.2 hUCMSCs 的培养与诱导分化 采取第3～6 代hUCMSCs 接种于实验所需孔板中，待细胞生长融合达到 50% 时，将细胞分为 4 组：对照（control）组［DMEM/F12 培养基培养1 周后，转染空载pCMV-HA和随机 siRNA（siControl）48 h］、E2F1 过表达（E2F1）组（EDM 内皮诱导分化培养基培养1 周后，转染E2F1-pCMV-HA 质粒 48 h）、敲减DNMT3A组（EDM内皮诱导分化培养基培养1周后，转染靶标DNMT3A的siRNA 48 h）和联合诱导组（EDM 内皮诱导分化培养基培养1 周后，转染E2F1-pCMV-HA 质粒和靶标DNMT3A 的 siRNA 48 h），持续诱导 1 周后，倒置显微镜下对细胞形态学进行观察，并进行后续实验。

3.3 总RNA 提取与RT-qPCR 每孔1×105个接种hUCMSCs 细胞于6 孔板，生长至50% 汇合后进行诱导，各组细胞诱导结束后，使用Trizol 试剂从hUCMSCs 中分离总 RNA，每管 RNA 样品中加入 200 μL氯仿进行抽提，提取结束后加入20 μL 的DEPC 水进行溶解并定量，取2 μg的RNA样品使用M-MLV逆转录酶进行逆转录，最后以cDNA 为模板，采用Bestar Sybr Green qPCR Master Mix 进行实时 PCR 系统进行扩增和监测，反应条件为 95 ℃10 s、60 ℃ 30 s，40 个循环。GAPDH 作为内参照，结果采用 2-ΔΔCt法进行相对定量分析。引物序列如表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

3.4 Western blot 以每孔1×105个接种hUCMSCs于6 孔板，生长至50%汇合后进行诱导，各组细胞诱导结束后，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取总蛋白；经BCA 法测定浓度后行聚丙烯酰胺凝胶电泳；按照半干转的方法将蛋白转印到NC 膜上；5%脱脂奶粉溶液37 ℃孵育2 h；Ⅰ抗4 ℃孵育过夜；TBST 洗膜后Ⅱ抗37 ℃孵育2 h；再次洗膜，使用Odyssey Infrared Imaging System 显色。用 ImageJ 图像分析软件进行半定量分析，GAPDH 作为内参照。

3.5 Matrigel管状结构形成实验 将96孔板放置在冰上，每孔加入40 μL 基质胶，置于37 ℃培养箱内1 h，待基质胶凝固备用。各组细胞处理结束后，向铺有基质胶的96 孔板中加入50 μL（2×104）细胞悬液，置于37 ℃培养箱内孵育2～4 h。倒置显微镜下观察拍照，使用ImageJ 软件对管状结构的长度进行分析统计。

3.6 基质胶塞实验 将处理结束后的各组细胞与Matrigel 基质胶1∶1 混合，注入免疫缺陷鼠背部皮下14 d 后，取出形成的Matrigel plug，进行组织切片，利用免疫组化CD31染色来观察血管形成。

4 统计学处理

采用GraphPad Prism 6.0 统计软件进行分析，数据均采用均数±标准差（mean±SD）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用 Bonferroni 校正的t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 定向诱导hUCMSCs分化为血管内皮细胞

流式细胞术检测结果显示，本实验分离得到的hUCMSCs 高表达基质细胞表面标记CD44 和CD90，不表达造血干细胞的特异性标记CD34 和CD45（图1）。将hUCMSCs置于EDM 内皮诱导分化培养基中，同时转染E2F1 过表达质粒与靶标DNMT3A 的siRNA，培养一周后，倒置显微镜形态学观察结果显示，control组的细胞体积较大，形态完整，细胞呈梭形或纺锤形；诱导分化后 ，E2F1 组、siDNMT3A 组和E2F1+siDNMT3A 组的细胞出现内皮样形态改变，细胞体积缩小，形态趋于卵圆形或多角形，呈大小不一的铺路石样排列（图2）。

Figure 1. The hUC-MSCs were analyzed by flow cytometry for expression of cell surface markers associated with MSCs phenotype.图1 hUCMSCs免疫表型的流式鉴定

Figure 2. Morphological changes of hUCMSCs differentiating into vascular endothelial cells. The scale bar=50 μm.图2 hUCMSCs向血管内皮细胞分化的形态变化

2 动脉标志性基因、间充质干细胞标记基因、DNMT3A和E2F1的mRNA水平检测

利用RT-qPCR 实验检测动脉标志物（ephrin-B2和HEY2）、间充质干细胞标记基因（CD44和OCT4）、DNMT3A 和E2F1 的mRNA 水平表达情况。结果如图3所示，与对照组相比，单独过表达E2F1（E2F1）组E2F1 的mRNA 水平显著升高（P＜0.01），ephrin-B2（P＜0.05）与 HEY2（P＜0.01）的 mRNA 水平均升高，而CD44 与 OCT4 的 mRNA 水平均降低（P＜0.01）；敲减DNMT3A（siDNMT3A）组DNMT3A（P＜0.01）的mRNA水平显著降低，ephrin-B2（P＜0.05）与 HEY2（P＜0.05）的 mRNA 水 平 均 升 高 ，而 CD44 与 OCT4 的mRNA 水平均降低（P＜0.01）；与单独过表达E2F1 组和siDNMT3A 组相比，联合诱导（E2F1+siDNMT3A）组 ephrin-B2（P＜0.01）与HEY2（P＜0.01）的mRNA 水平均升高，而 CD44（P＜0.05）与 OCT4（P＜0.01）的mRNA水平均降低。

3 动脉标志性基因的蛋白水平检测

利用Western blot 实验检测动脉标志物ephrin-B2与HEY2的蛋白表达水平，结果如图4 所示。与control 组 相 比 ，E2F1 组 的 ephrin-B2（P＜0.01）与HEY2（P＜0.05）的蛋白水平均上调；与 control 组相比，siDNMT3A 组的ephrin-B2与HEY2的蛋白表达上调（P＜0.01）；分别与 E2F1 组和siDNMT3A 组相比，联合诱导组ephrin-B2 与HEY2 的蛋白表达水平显著性升高（P＜0.01）。

4 体外管状结构形成的检测

为研究过表达E2F1 与敲减DNMT3A的hUCMSCs是否具有血管生成的能力，利用Matrigel检测hUCMSCs的管状结构形成情况，结果如图5所示。对照组中hUCMSCs 的形态呈长梭形、多角形，少数细胞形成突起，细胞与细胞之间连接不完整，不能形成管腔样结构；其他诱导分化的3 组细胞均可形成细胞与细胞之间连接，形成较为完整的管腔样结构，其中联合诱导组形成较多的管腔样结构，互相交联成网状结构，见图5A。使用ImageJ 软件对诱导后细胞形成管状结构的总长度进行统计分析，发现E2F1组和siDNMT3A 组形成管状结构的总长度明显大于对照组（P＜0.01）；联合诱导组形成管状结构的总长度明显高于 E2F1 组和 siDNMT3A 组（P＜0.01），见图5B。

5 体内血管生成的检测

Figure 3. Changes of CD44，OCT4，E2F1，DNMT3A，ephrin-B2 and HEY2 mRNA levels during hUCMSCs differentiation into vascular endothelial cells. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs E2F1 group；▲▲P＜0.01 vs siDNMT3A group.图3 hUCMSCs向血管内皮细胞分化过程中CD44，OCT4，E2F1，DNMT3A，ephrin-B2与HEY2的mRNA水平的变化

Figure 4. Changes of ephrin-B2 and HEY2 protein levels during hUCMSCs differentiation into vascular endothelial cells. Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs E2F1 group；▲▲P＜0.01 vs siDNMT3A group.图4 hUCMSCs向血管内皮细胞分化过程中ephrin-B2与HEY2蛋白水平的变化

为了更深入探究过表达E2F1 与敲减DNMT3A是否能在体内诱导hUCMSCs 形成血管样结构，利用体内基质胶塞实验结合CD31 染色检测裸鼠体内血管生成情况。免疫组织化学结果显示，对照组中较少细胞呈现CD31 染色阳性，并且没有管腔样结构；E2F1 组与siDNMT3A 组中CD31 的蛋白水平及血管环数均显著升高（P＜0.01）；联合诱导组CD31的蛋白水平及血管环数最高，差异有统计学意义（P＜0.01），见图6。

讨 论

Figure 5. Tube formation assay in vitro. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs E2F1 group; △△P＜0.01 vs siDNMT3A group.图5 体外管型结构生成实验

Figure 6. Matrigel plug assay in vivo. The scale bar=100 μm. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs E2F1 group;▲▲P＜0.01 vs siDNMT3A group.图6 体内基质胶塞实验

间充质干细胞具有重要的组织修复和再生生物学特性，其向血管内皮细胞分化的能力使其成为构建组织工程化血管种子细胞的主要来源，并且可以进一步应用于临床缺血性疾病的治疗。早期诱导间充质干细胞向血管内皮细胞分化主要依赖于多种生长因子提供的微环境。例如，VEGF、FGF2、EGF 和IGF 可以诱导间充质干细胞向血管内皮细胞的分化［17-18］，也有在基础培养基中添加不同浓度VEGF、FGF［13，19-20］。敲减rBP-JK能够促进骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞的分化，这一过程可能受aKT/NF-κB 信号的调节［11］；5F 肽通过激活ERK1/2 信号通路来促进骨髓干细胞向内皮细胞分化［21］；血管内皮细胞上清液可能通过VEGF 以外的途径诱导MSCs 向血管内皮细胞分化［22］。我们的研究证实过表达E2F1 同时敲减DNMT3A能够协同诱导MSCs 向内皮细胞分化，并促进间充质干细胞的血管生成。

E2F1 是一种参与细胞周期调控和凋亡的转录因子，在细胞周期进程、DNA 损伤反应和细胞凋亡中起着重要作用［23］。E2F1 的转录激活能力受 pRb 调控，以低磷酸化形式，pRb 结合并使E2F1 的DNA 结合和反式激活功能失活，与细胞因子（IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、TGF-β、G-CSF、LIF）、生长因子（EGF、KGF、VEGF、IGF、FGF、PDGF、HGF、NGF）和干扰素（IFN-α、IFN-β、IFN-γ）都有相关性［24］。E2F1 能够结合并激活人VEGFC 和VEGFR3 基因的启动子，刺激体外培养的内皮细胞形成小管样结构，并促进体内新血管的形成［25］。我们前期研究证实E2F1 可以激活动脉内皮细胞标志性基因ephrin-B2和HEY2的转录，并促进人脐动脉血管内皮细胞的血管生成［26］。ephrin-B2 和 HEY2 在动脉内皮细胞中特异性表达［27］。ephrin-B2 是一种Eph 受体酪氨酸激酶的跨膜配体，可促进内皮血管生成的发芽行为和运动［28］。在缺氧条件下，通过ephrin-B2 的去甲基化可以有效地诱导脂肪间充质干细胞分化为血管内皮细胞系［29］。ephrin-B2/EphB4 信号转导调控牙髓干细胞诱导内皮细胞新生血管生成［30］。HEY1 和 HEY2 在胚胎血管发育和动脉命运决定中起着关键作用［31］。本研究结果证实在间充质干细胞中过表达E2F1，可以促进间充质干细胞向动脉血管内皮细胞的分化，并促进体内外血管生成。

DNA 甲基化是一个表观遗传过程，与发育、衰老和肿瘤有关，通常发生于基因的启动子，也可以发生在外显子、内含子、转座子和调控元件等DNA 序列［32］。DNMT3A，作为一种从头合成的 DNA 甲基转移酶，在表观遗传中起着重要的作用。然而，对于DNMT3A 在血管生成中的作用研究较少。Gao 等［33］报道了DNMT3A 在肿瘤血管生成中的作用，DNMT3A缺失促进肺肿瘤的进展和侵袭。我们之前的研究发现，DNMT3A 是内皮细胞标记基因表观遗传沉默的关键调节因子，敲低DNMT3A能促进间充质干细胞向动脉内皮细胞的分化［14］。本研究发现敲减DNMT3A同时过表达E2F1 可以促进间充质干细胞向动脉血管内皮细胞的分化，上调动脉特异性标志物ephrin-B2和HEY2的表达，促进体内外血管形成。

综上所述，我们的研究一方面为间充质干细胞向动脉血管内皮细胞分化诱导方案提供新的思路，另一方面为动脉血管内皮细胞分化过程中特异性标志物的表达调控机制解析方面提供实验基础。因此，这些发现可能为间充质干细胞用于“治疗性血管新生”的研究提供一个思路，并为血管化组织工程研究提供了新的依据。