STAT3在骨肉瘤中的研究进展

钟彬龙， 邵增务

华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科医院，武汉 430022

骨肉瘤是最常见的骨源性恶性肿瘤，多见于儿童和青少年。骨肉瘤的发病率虽然不高，但是其具有极高的致残致死率,而对患者及其家庭、社会带来了巨大的精神和经济负担[1-3]。早期骨肉瘤症状较不明显，很多患者在第一次就医时就已经出现远处转移。近年来随着规范化化疗和手术治疗的进步，骨肉瘤患者预后已经得到了较大改善，但是对于已经出现远处转移的患者，其5年生存率仍不足20%[4]。

信号转导和活化转录因子(signal transducers and activators of transcriptions，STATs)是一组具有SH2(Src homology-2)蛋白结构域的胞质蛋白，在细胞中作为信号转导信使和转导因子，参与正常细胞对各种细胞因子和生长因子的应答。目前STATs已被证实参与基因表达的调控，如胚胎发育、程序性细胞死亡、器官形成、先天性和后天性免疫获得等。STAT3是STATs中较为重要的一员，被细胞因子等激活后参与调节多种细胞生物学行为和功能，如细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、肿瘤新生血管形成及免疫逃逸等，在恶性肿瘤的发生发展中发挥关键作用[5-6]。

1 STAT3的结构

STAT3的编码基因位于17号染色体长臂2区1带2号亚带中(17q21.2)，由750～795个氨基酸组成，蛋白分子质量约89 kD。STAT3蛋白的功能结构域与STAT家族的其他成员相似，包括有：①一个起始于130氨基酸的氨基端卷曲螺旋结构域，参与蛋白质-蛋白质相互作用；②中心一个DNA结合结构域，位于320～490氨基酸之间；③490～580氨基酸为连接器结构域，该结构域关系到STAT3与DNA结合的稳定性；④一个SH2结构域，位于580～680氨基酸之间；⑤705氨基酸处为Tyr705酪氨酸磷酸化位点，较为保守；⑥一个羧基转化结构域，其中Ser727位点为丝氨酸磷酸化位点。SH2结构域和羧基转化结构域之间的Tyr705磷酸化后则引起2个STAT3分子的同源或者异源二聚体化，促进STAT3与DNA的结合[7]。

2 STAT3的生物学功能

在正常细胞中，为了避免产生异常的基因表达，STAT3的激活控制十分严格。细胞因子等刺激后15～60 min STAT3的磷酸化即到达峰值，并在数小时后开始下降[8]。整个过程受到负向调节蛋白的调控，如细胞因子信号蛋白抑制子家族(SOCS1～7)和CIS，活化后STATs蛋白抑制子(PIAS)，以及包括SHP-2、PTP1B、TC45、SHP-1和泛素依赖性蛋白体降解系统在内的蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTPs)[9]。STAT3的组成性激活在细胞增殖、存活、炎症反应、侵袭、转移和血管形成等中起重要作用。活化后的STAT3形成二聚体进入细胞核中，与下游Cyclin D1、Cyclin B和cdc2启动子结合启动转录，促使细胞周期的运转而起到促进细胞增殖的作用。另一方面，STAT3通过下调促凋亡因子，如Fas，来间接促进细胞增殖。此外，STAT3还可通过调节Survivin、Bcl-2、BclxL和Mcl-1等抗凋亡蛋白的基因表达来实现促进肿瘤细胞存活、抑制凋亡的目的。

3 STAT3在骨肉瘤中的作用

3.1 STAT3表达在骨肉瘤中的临床意义

STAT3在许多常见恶性肿瘤中往往表现出高表达，如乳腺癌、前列腺癌、尿路上皮癌、肺癌等[10-13]。同样的，在骨肉瘤肿瘤组织中STAT3也呈现出异常的高表达[14-16]，并对病情发展及预后具有指导意义。

Ryu等[14]发现骨肉瘤组织中STAT3均呈现出结构化高表达，且磷酸化STAT3(p-STAT3)在大部分骨肉瘤患者中过表达，p-STAT3高表达患者的预后明显较低表达者差。

Wang等[16]收集了76例骨肉瘤患者的肿瘤标本与正常骨组织、软骨组织进行比较，发现骨肉瘤组织中STAT3的mRNA水平和蛋白水平明显增高。STAT3的蛋白表达水平与肿瘤分化、肿瘤转移相关，而与肿瘤大小、位置和病理分型无明显相关性。组织中高表达STAT3的骨肉瘤患者5年无病生存率和总生存率(21.8%和23.5%)均较低表达组(57.5%和60.8%)低[16-17]，STAT3在肿瘤中的表达是骨肉瘤无病生存率和总生存率的一个独立预后因素。

骨肉瘤化疗和手术治疗的发展给大多数骨肉瘤患者的长期生存带来了福音，但是仍有30%～40%的患者在后期发生骨肉瘤复发，其中约70%的患者因骨肉瘤复发进展而死亡。Salas等[18]利用化疗后骨肉瘤坏死率是否大于90%将患者分为化疗敏感和不敏感两个组别进行基因和蛋白水平的对比，发现化疗不敏感组的骨肉瘤患者肿瘤组织中STAT3和ERK1的mRNA水平异常增高，且化疗不敏感患者的组织中p-STAT3和p-ERK1蛋白表达明显增高。联合p-STAT3和p-ERK1可对患者化疗敏感与否进行准确预测，阳性预测值大于90%。利用该预测方案可在肿瘤处穿刺进行病理诊断的同时开展患者对化疗方案是否敏感的预测，指导化疗策略的制定。

3.2 STAT3对骨肉瘤细胞的影响

3.2.1 细胞周期与增殖 在细胞周期中，细胞进行基因组的自我复制、细胞生长并进一步分裂为2个子细胞，完成增殖过程。p-STAT3的结构性表达促进重要周期相关蛋白的异常表达，引起肿瘤细胞不可控的细胞增殖，与肿瘤细胞周期密切相关的有Cyclin D1、Cyclin B和cdc2。其中Cyclin D1在G0/G1期向S期转化中起重要作用，Cyclin D1合成后结合CDK4和CDK6，形成Cyclin D1-CDK4/6复合物，进一步磷酸化下游Rb基因[19]，释放E2F蛋白以启动其他基因的转录过程。研究表明骨肉瘤细胞系高表达STAT3和p-STAT3，抑制STAT3活化可以下调Cyclin D1的表达，进一步抑制骨肉瘤细胞的增殖能力[20-22]。长链非编码RNA HOXD-AS1被认为是一种原癌基因，在骨肉瘤中高表达且具有促肿瘤作用。HOXD-AS1可能是通过上调STAT3及其活性而增加Cyclin D1、Bcl-2和MMP-2的表达进而达到促骨肉瘤增殖作用[23]。敲低HOXD-AS1的同时可观察到STAT3的激活受到抑制，Cyclin D1表达下降，细胞被阻滞于G0/G1期[23]。相似的，STAT3还可作为下游效应分子参与miR-126[24]、miR-199a-3p[25]、miR-199a-5p[26]、miR-19[27]和miR-125b[28]等非编码RNA对骨肉瘤细胞增殖过程的调控。

3.2.2 细胞凋亡与存活 细胞凋亡是一种细胞的程序性死亡，正常情况细胞凋亡和细胞生存相互牵制处于平衡状态。恶性肿瘤中，肿瘤细胞通过表达抗凋亡蛋白(如Bcl-2)、下调或者突变促凋亡蛋白(如Bax)以获得对细胞凋亡的耐受性，导致其突破正常寿命而异常存活。许多抗凋亡分子，如Survivin和Bcl家族(Bcxl、Bcl-2、Mcl-1)是STAT3的下游靶基因，受到STAT3的正向调控[15，21]。Couto等[20]利用小分子抑制剂LLL12抑制STAT3活性后探索4种犬类骨肉瘤细胞系的凋亡水平，发现当STAT3被抑制后骨肉瘤细胞的凋亡水平增高，STAT3下游靶基因Cyclin D1、Bcl-2、Mcl-1和Survivin均受到抑制。另外，使用STAT3抑制剂LLL3或S31-201，或利用siRNA敲低STAT3也可观察到骨肉瘤细胞由Caspase3/7介导的细胞凋亡增加[15，21]。通过药物筛选，Oi等[29]发现葫芦素I(cucurbitacin I)可降低STAT3活性，增加骨肉瘤细胞凋亡水平，上调Mcl-1、cleaved PARP和Caspase-3等凋亡相关蛋白[29]。

3.2.3 迁移和侵袭 恶性肿瘤的局部侵袭性和远处转移是临床诊疗中的棘手问题之一。金属基质蛋白酶(MMPs)在组织重构中发挥关键作用，其主要功能是降解并重组细胞间质。恶性肿瘤中MMP-2和MMP-9分泌增加以降解细胞基底膜，使肿瘤细胞向外侵袭周围正常组织。同时MMPs还可促进肿瘤微环境中VEGF和EGF等的水平，导致肿瘤新生血管形成，引起肿瘤向远处转移。恶性肿瘤中异常表达的STAT3激活金属基质蛋白酶MMP-2，MMP-1，MMP-9及MMP-10的转录，促进肿瘤细胞的侵袭和迁移。在骨肉瘤中，肿瘤相关巨噬细胞(TAM)通过上调p-STAT3、MMP-9和COX-2的表达促进骨肉瘤细胞的转移和上皮间质转化(EMT)[30]。Tu等[31]发现间充质干细胞可以向骨肉瘤细胞分泌IL-6，并通过磷酸化STAT3促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力，提示骨肉瘤周围正常骨中的间充质干细胞可通过STAT3通路促使骨肉瘤的转移并抑制肿瘤细胞凋亡[31]。小分子化合物LLL12和LLL32作为STAT3的特异性抑制剂，可以抑制IL-6诱导的STAT3活化，使骨肉瘤细胞迁移和侵袭能力受到抑制，同时降低肿瘤的形成能力[32]。

3.2.4 血管形成 肿瘤内部形成的复杂微血管网络结构确保了肿瘤整体细胞生长所需的营养物质和氧气，并提供了一个有效的代谢废物排泄途径，在肿瘤生长和转移中起重要作用[33]。结构化STAT3的激活参与了恶性肿瘤在体内的新生血管形成过程[34]。在头颈部恶性肿瘤和恶性黑色素瘤中发现异常表达的STAT3可以上调VEGF的表达，从而促进肿瘤微血管的新生[35]。阻断STAT3信号通路可以抑制由Src诱导的VEGF上调，显著下调VEGF依赖的血管渗透性[36]。越来越多研究表明转移性骨肉瘤通过血管新生和仿血管生成形成十分复杂和强健的血管体系。更特殊的是，转移性骨肉瘤细胞可以通过仿血管生成直接形成肿瘤血管，无需依赖血管内皮细胞的参与[37-38]。Bao等[39]发现非洲防己碱可以显著降低p-STAT3的水平，抑制细胞增殖和骨肉瘤细胞所介导的血管新生。抑瘤素M是IL-6细胞因子家族的一员，Fossey等[40]发现人和犬类骨肉瘤细胞中有抑瘤素M受体的表达，外源性给予抑瘤素M促进了STAT3的磷酸化并上调Src和JAK2活性，显著增加骨肉瘤细胞VEGF的表达，促进骨肉瘤新生血管形成，使用STAT3特异性抑制LLL3可抑制由抑瘤素M诱导的STAT3激活和肿瘤血管形成。同样的，Xie等[41]发现中药单体成分青藤碱可以通过CXCR4-STAT3信号轴抑制骨肉瘤肿瘤相关血管的形成。

4 STAT3抑制剂在骨肉瘤中的研究

STAT3的结构性表达在骨肉瘤等恶性肿瘤增殖、凋亡、迁移、侵袭以及血管形成等中发挥重要作用，因此有必要将STAT3作为治疗恶性肿瘤的新靶点，研发新型抑制剂用于临床。

4.1 合成特异性小分子抑制剂

4.1.1 LLL3 LLL3是一种基于蒽主链衍生物的小分子化合物，其结构类似于STA-21(一种已被成功用于抑制STAT3表达细胞的化合物)。LLL3较STA-21易于合成，且仍具有STA-21结合STAT3 SH2结构域并抑制其与DNA结合启动转录的功能[42]。LLL3处理后骨肉瘤细胞STAT3与Survivin启动子的结合减少，并浓度依赖和时间依赖性地降低骨肉瘤细胞的增殖水平，上调Caspase3/7活性，增加细胞凋亡。LLL3还可通过抑制STAT3活性降低MMP-2和VEGF的表达，抑制骨肉瘤细胞侵袭能力和血管新生能力[15]。

4.1.2 LLL12 LLL12是一种优化后的LLL3类似物，其通过结合STAT3单体的T705磷酸化位点阻断STAT3的二聚体化，使其不能顺利进入细胞核中发挥作用。Couto等[20]使用LLL12处理犬类骨肉瘤细胞，发现LLL12可以抑制骨肉瘤细胞的增殖、诱导细胞凋亡，抑制STAT3的磷酸化并下调STAT3下游靶基因(Survivin，Cyclin D1，Mcl-1和Bcl-2)的转录而起到抗骨肉瘤的作用。除此之外，LLL12与骨肉瘤经典化疗药多柔比星具有互相协同的抗骨肉瘤效应。抑制STAT3磷酸化后，LLL12还可下调VEGF、MMP-9、血管生成素1/2、组织因子和FGF-1的表达，抑制骨肉瘤新生血管的形成[43]。

4.1.3 FLLL32 FLLL32是姜黄素的小分子类似物，较姜黄素更具选择性地抑制JAK2/STAT3信号通路，能更有效且牢固地结合STAT3的SH2结构域，抑制STAT3二聚体化。在骨肉瘤中，FLLL32降低了STAT3与DNA结合的能力下调总STAT3和p-STAT3的表达，抑制细胞增殖和迁移，并促使细胞发生Caspase3依赖性的细胞凋亡。STAT3下游靶基因如Survivin、VEGF、MMP-2的mRNA和蛋白水平也随之下降[32，44]。

4.1.4 阿帕替尼(Apatinib) 阿帕替尼是一种新型的高选择性抑制血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)酪氨酸激酶，在多种恶性肿瘤中发挥重要的抗血管形成作用，目前已被用于胃癌等多种癌症的靶向治疗。在骨肉瘤中，阿帕替尼可抑制骨肉瘤细胞的生长，将细胞阻滞于G0/G1期，诱导细胞凋亡和自噬[45]。阿帕替尼通过抑制STAT3和Bcl-2的表达，降低STAT3活性，抑制骨肉瘤细胞迁移、侵袭能力，下调骨肉瘤内皮间质化进程[46]。

4.2 天然产物抑制剂

除了人工合成的小分子STAT3抑制剂外，近年来对天然产物的研究越来越多，其提取物中不断涌现出可以抑制STAT3通路的单体成分。

4.2.1 葫芦素I(Cucurbitacin I)和葫芦素B(Cucurbitacin B) 葫芦素是葫芦科植物中提取出来的三萜甾醇类物质，由于其具有抗炎止痛的效果已经作为一种传统药物广泛应用于治疗中。近年来葫芦素B、D、E、Q和I等葫芦素衍生物相继被提取出来，研究发现部分葫芦素还具有抗肿瘤作用。其中葫芦素I具有明显细胞毒性和抗增殖作用，能抑制STAT3的激活。葫芦素I能够浓度依赖和时间依赖地抑制骨肉瘤细胞的增殖，抑制STAT3的活化和Mcl-1、Cyclin D1、c-Myc和Survivin的表达，促进细胞凋亡，增加cleaved PARP和cleaved-Caspase3的水平[29]。葫芦素B也是一种STAT3抑制剂，通过抑制JAK2/STAT3通路信号和MMP-2、MMP-9介导抑制骨肉瘤增殖、迁移，促进细胞凋亡。葫芦素B处理后的骨肉瘤细胞VEGF水平明显下降，表明葫芦素B还具有抑制骨肉瘤血管形成的功能[47]。

4.2.2 4-甲氧基黄檀醌(4-methoxydalbergione，4-MD)和4-parvifuran 降香黄檀(D.odorifera)是一种主要分布于中国的植物，其心材常被中国和朝鲜人当做一种治疗血液性疾病、缺血性疾病、水肿、风湿痛等疾病的传统药物。Park和Yun等[48-49]从降香黄檀中提取出4-甲氧基黄檀醌(4-MD)和4-parvifuran两种有效单体，发现二者均通过JAK2/STAT3信号通路抑制STAT3的磷酸化发挥抗肿瘤作用。其中4-MD可以上调骨肉瘤细胞cleaved-Caspase3和cleaved-PARP的水平，降低Bcl-2、Bcl-xl和Survivin等抗凋亡蛋白的表达。4-parvifuran除了发挥抑制增殖和促进凋亡作用外，对骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力也有抑制作用，并下调MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白水平。

4.2.3 维泰醇(Alternol) 维泰醇是一种新型的活性单体成分，通过红豆杉树皮中一种微生物菌诱变株发酵纯化而来。维泰醇和紫杉醇一样均具有一定的抗肿瘤功效，在多种肿瘤中表现出致周期阻滞和诱导细胞凋亡等特性[50]。维泰醇可抑制骨肉瘤细胞STAT3的活化，降低细胞增殖和迁移能力。维泰醇还可导致骨肉瘤细胞活性氧ROS的增加，JNK、ERK1/2和p38通路的激活，表明ROS依赖的MAPK信号通路和STAT3信号通路在维泰醇抑制骨肉瘤过程中起重要作用[51]。

4.2.4 银杏素(Ginkgetin) 银杏素是一种从银杏叶中偶然分离而来的双黄酮类分子，具有调血脂、治疗心绞痛、消炎抗氧化等疗效。近十多年来研究发现银杏素还具有抗肿瘤的作用。Xiong等[52]将银杏素应用于骨肉瘤的研究中，发现银杏素可以抑制STAT3的激活，具有较强细胞毒性，可以抑制骨肉瘤细胞生长，激活Caspase3/9途径细胞凋亡。银杏素通过抑制STAT3磷酸化下调其下游靶基因Bcl-2、Bcl-xL、Survivin和Cyclin D1的表达。

4.2.5 白藜芦醇(Resveratrol) 白藜芦醇是一种天然的多酚化合物，存在于多种植物体内，如桑树、花生、葡萄等，具有抗病毒、抗肿瘤、调血脂等生物活性。研究报道白藜芦醇具有抗白血病、前列腺癌、胃癌等恶性肿瘤的作用，且能够诱导胰腺癌肿瘤干细胞的凋亡[53]。白藜芦醇抑制骨肉瘤细胞活力和自我更新，降低骨肉瘤细胞的肿瘤形成能力。白藜芦醇可通过下调STAT3磷酸化水平抑制JAK2/STAT3通路的活性，降低CD133而降低骨肉瘤干细胞的干性。外源性给予STAT3可以减弱白藜芦醇对骨肉瘤干细胞的抑制作用[54]。

4.2.6 其他天然抑制剂 除了上述几种天然STAT3抑制剂外，氯原酸、蓝萼甲素A、千金藤素等[41，55-56]也具有STAT3抑制活性和抗骨肉瘤作用。氯原酸能以剂量依赖性方式抑制骨肉瘤细胞的细胞活力，通过抑制STAT3/Snail通路的活性诱导细胞增加Caspase3/7活性导致细胞凋亡[56]。蓝萼甲素A抑制STAT3的磷酸化而不降低总STAT3的表达，降低STAT3下游基因如Cyclin D1和BCl-2的表达，还可以抑制IL-6诱导的STAT3在细胞核中的聚集[57]。与蓝萼甲素A不同，千金藤素下调STAT3磷酸化水平的同时也抑制了总STAT3的表达，STAT3的下游基因Bcl-xL、c-Myc和Cyclin D1也受到抑制[58]。

5 展望

STAT3在恶性肿瘤如乳腺癌、肺癌、卵巢癌等中常常表现出结构性表达，在肿瘤细胞生长、增殖、凋亡和肿瘤发生中起重要作用。在骨肉瘤中，STAT3同样发挥着促进骨肉瘤作用，而人为抑制STAT3的激活则出现骨肉瘤细胞增殖、血管形成、侵袭和迁移受抑制，同时细胞凋亡增多的治疗作用。

已有较多研究表明肿瘤组织中异常表达的STAT3和p-STAT3可以作为骨肉瘤预后、化疗药敏感与否的辅助指标，但是目前该指标仍未进入临床试验，说明STAT3在临床预后应用中的证据仍有不足，需要大样本多中心的临床探索给予实践支撑。

骨肉瘤中STAT3的表达异常还可以作为研发新型靶向治疗的线索，或许在未来使用STAT3抑制剂进行靶向治疗是一种不错的选择。根据STAT3激活的过程，阻断或者抑制STAT3的策略可有以下几种：①抑制细胞膜上受体配体复合物的形成；②阻断磷酸化受体胞质端的激酶；③诱导增强可以将p-STAT3去磷酸化的磷酸化酶的活性；④抑制JAK激酶以阻止STAT3的二聚体化；⑤阻止STAT3向核内转移；⑥抑制STAT3与DNA结合，阻断其促转录作用；⑦反义STAT3策略的应用；⑧诱骗寡聚脱氧核苷酸。目前已有一部分人工合成和天然的STAT3抑制剂引起了研究者的重视，但是这些抑制剂的具体机制尚不明确，且没有一种抑制剂真正进入了骨肉瘤治疗临床试验阶段。因此研发具有临床意义的STAT3抑制剂仍是未来科研和临床工作者的巨大挑战之一。