DDX3的病理生理学作用

徐伍， 徐瑞， 张信琴， 林加龙， 裴海峰

(1.成都中医药大学 医学与生命科学学院，四川 成都 611130；2.西南交通大学 医学院，四川 成都 610031；3.成都医学院 护理学院，四川 成都 610500；4.中国人民解放军西部战区总医院 心内科，四川 成都 610083)

DEAD-box蛋白质家族隶属于解旋酶超家族Ⅱ，是最大的解旋酶家族，因其结构特征基序Asp(D)-Glu(E)-Ala(A)-Asp(D)而得名[1-2].DEAD-box蛋白具有独特的12个保守基序，是其结合、水解ATP以及与RNA相互作用的结构基础[3].DEAD-box RNA解旋酶3(DEAD-box RNA helicase 3,DDX3)是DEAD-box蛋白家族的重要成员，具有DEAD-box RNA解旋酶3 Y连锁(DEAD-box RNA helicase 3 Y-linked，DDX3Y)和DEAD-box RNA解旋酶3 X连锁(DEAD-box RNA helicase 3 X-linked，DDX3X)两个同源物, 往往也将DDX3引为DDX3X.DDX3Y基因位于Y染色体上，仅表达雄性生殖系统[4-5]；而DDX3X基因位于X染色体上，广泛表达于全身各组织，并参与细胞周期进展、先天免疫反应、细胞凋亡、癌症发生与抑制、病毒的复制周期等多种重要的细胞生理过程，因而受到了人们的广泛研究[6-9].本研究旨在系统总结DDX3的病理生理学作用，着重其与疾病的关系及生物学作用，以期探明可能的研究方向.

1 DDX3简介

DDX3作为一种结构高度保守并依赖ATP的RNA解旋酶，广泛存在于各类真核生物中.1997年研究人员首次发现了人源DDX3蛋白，并通过原位杂交技术将其基因精确定位于Xp11.3-p11.23位点[10].人源DDX3编码基因长约16KB，共包含16个内含子及17个外显子，编码5.3KB转录本，对应662个氨基酸的多肽，富含丝氨酸(11.3%)和甘氨酸(11.4 %)[4,11].与所有的DEAD-box RNA解旋酶相似，DDX3的解旋酶核心由两个类似RecA样结构域构成，其中包含13个特征性解旋酶序列基序，并包括同义基序Ⅱ，该基序以单个字母代码读取为D-E-A-D[12-13]. DDX3解旋酶核心的两侧分别是一个序列复杂度低且具有RS样结构域的C末端和一个带有核输出信号(nuclear export signal，NES)且序列复杂度低的N末端[12，14].研究人员通过蛋白质结晶技术和X射线衍射分析，准确得到了DDX3解旋酶结构域的晶体结构，该晶体属于单斜空间群P21，其具体晶胞参数：a=43.85 Å,b=60.72 Å,c=88.39 Å，α=γ=90°,β=101.02°，并发现DDX3结晶中存在共结晶配体，进一步研究发现该配体能提高DDX3的热稳定性[15-16].DDX3作为一种穿梭蛋白定位于细胞核和细胞质，并在其中发挥相应的病理生理学功能，既往研究发现DDX3未修饰单体形式(相对分子量为73.2)过大，无法有效通过核孔被动扩散进入细胞质，需要N末端富含亮氨酸的NES与核出口受体细胞染色体维持蛋白1 (chromosomal region maintenance 1, CRM1，也称Exportin-1)结合，从而定位至核膜孔的细胞质侧[17-18].最近发现，DDX3的核输出不仅由CRM1介导，还依赖于NES和以活化GTP结合形式运行的单体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白Ran[17].

2 DDX3的调控因素

许多因素会造成DDX3基因突变致使其功能的改变，研究人员通过外显子组测序在髓母细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌和血液系统恶性肿瘤中均发现了DDX3突变，DDX3的突变被认为是导致肿瘤发生的重要因素[19-21].DDX3的转录同样受到多种因素的调节，在人乳头瘤病毒相关的肺癌中，p53 对DDX3的转录发挥调控作用，p53的状态决定了DDX3的表达水平[22-23]；在乳腺癌伴缺氧条件下，低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)通过与正常乳腺上皮MCF10A细胞中DDX3启动子区的低氧诱导因子应答元件相结合，从而诱导激活DDX3的转录，因此核DDX3也被认为是乳腺癌不良预后的预测因子之一[24-25].丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的结构核心蛋白被认为是第一个可以与人类DDX3相互作用的病毒蛋白，相关功能实验表明，HCV核心蛋白也许能够增强DDX3转录共激活子的功能[11].在翻译水平，激活转录因子E74 样因子3(E74-like factor 3，elF3)和Cap依赖性翻译或抑制E74 样因子4(E74-like factor 4，elF4)均调控DDX3的翻译[26-27].另外DDX3的表达还受1型艾滋病病毒(human immunodeficiency virus type 1, HIV-1)Tat(HIV-1编码的反式激活因子)刺激[28]；在肝癌中，应用卡马拉素(rottlerin)可上调DDX3在肿瘤细胞中的表达[29].此外，生活习惯也密切影响着DDX3的表达，包括吸烟、饮酒及其他习惯，且男性表达水平高于女性[30].

3 DDX3与疾病的关系

DDX3对下游众多分子具有调控作用，参与了先天免疫反应、肿瘤的发生与抑制、病毒的周期复制等多种生物学过程，并在其中发挥了重要的病理生理学作用[7,9,31].长期以来，DDX3与疾病的关系被不断探索，其与肿瘤的研究成果丰富，与病毒之间也有明确的联系.

3.1 DDX3与肿瘤的关系

DDX3可充当酪蛋白激酶1ε(casein kinase 1ε, CK1ε)的调节亚基，直接结合CK1ε并刺激激酶活性，进一步促散乱蛋白 (disheveled protein，Dvl)磷酸化，从而使β-连环蛋白(β-catenin)移位进入细胞核并触发Wnt/β-catenin信号传导，Wnt/β-catenin信号下游有众多靶基因被调控，主要包括转录因子Snail1、基质金属蛋白酶7(matrix metalloproteinase 7，MMP7)、鼠类肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene, KRAS)、成纤维细胞特异蛋白1(fibroblast-fpecific protein 1,FSP1)和纤连蛋白等，这些靶点基因大多参与上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)、侵袭、炎症、迁移、凋亡和纤维化等过程[32-38].Wnt/β-catenin和EMT是DDX3在肿瘤发生发展过程中发挥致癌或抑癌双重作用的关键.

在KRAS突变的结直肠癌细胞中，质粒构建与转染结果表明DDX3可通过CK1ε/Dvl2轴激活β-catenin/T细胞因子(T cell factor，TCF)，进而促进细胞侵袭和异种移植肺肿瘤的结节形成[39]；而在KRAS野生型结直肠癌细胞中，发现DDX3可通过DDX3/KRAS/ROS/HIF-1α/DDX3级联反馈环增强细胞侵袭性[40].以上研究明确DDX3的致癌作用，解释了高表达DDX3结直肠癌患者临床总体生存率较差的原因[41].大型队列分析发现低表达DDX3的结直肠癌患者预后也较差，且癌细胞向远处转移更加频繁.进一步实验发现低表达DDX3可激活Snail/E-钙粘着蛋白(E-cadherin)信号通路，从而促进了结直肠癌转移[42].因此，DDX3也被认为具有抑癌作用.

在非小细胞肺癌中，应用质粒构建等方法，使E6癌蛋白和p53突变共同诱导DDX3失活，MDM2/Slug/E-cadherin途径就被激活，表现为肿瘤恶性程度增加和预后不良，反映了DDX3的抑癌作用[22]；而在小细胞肺癌中，高表达DDX3与癌细胞的发生发展紧密相关[43].尽管DDX3在肺癌中发挥双重作用，但目前被视为肺癌的治疗靶点，本研究认为不应一概而论，临床应用应遵循个体化精准医疗.

在肝癌细胞中检测到过表达DDX3，经锚定非依赖性生长分析，其被鉴定为肝癌发生中的转化基因[44]；Chang等[45]发现，在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)阳性的原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者中，DDX3表达水平较低，而在HCV阳性的患者中则不表达，进一步通过集落形成实验和质粒构建发现，DDX3主要通过与特异性蛋白1(specificity protein 1，SP1)结合而增强p21(waf1/cip1)启动子活性的转录来发挥其对肿瘤生长的抑癌作用[46].由于DDX3同样与病毒有着直接关联，故在研究肝癌时不应忽略病毒的效应.

在口腔鳞状细胞癌中，非吸烟患者的组织免疫组化染色表明，低表达的DDX3严重影响总体生存率[30]；对吸烟患者而言，高表达DDX3与淋巴转移相关并可预测不良生存率[47].这种现象可能是因为吸烟作为一种诱因造成DDX3突变，使其由抑癌转变为致癌.

荧光素酶报告表明，被HIF-1α上调后的DDX3通过诱导EMT进程的方式增强乳腺癌侵袭[22]；髓母细胞瘤细胞活力增加则是由于DDX3突变与突变的β-catenin结合增加了TCF启动子的反式激活[48].目前，DDX3对于癌症的发生发展起着促进或抑制双重作用，明确两者间的关系一直备受关注，理清此关系能为癌症的治疗提供更多的可行途径.

3.2 DDX3与病毒感染的关系

在免疫反应中，DDX3发挥着重要的抗病毒作用，主要调节视黄酸诱导型基因I(retinoic acid-inducible gene I，RIG-I)样受体介导的抗病毒应答，激活的RIG-I结合线粒体抗病毒信号(mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS)衔接蛋白，最终致使I-κB激酶-ε(I-kappa-B kinase-ε，IKKε)和TANK结合激酶1(tank binding kinase-1，TBK1)复合物的募集， IKKε/TBK1复合物能使干扰素调节因子3(interferon regulatory factors 3，IRF3)、干扰素调节因子7(interferon regulatory factors 7，IRF7)磷酸化和核易位，从而激活Ⅰ型干扰素(type-I interferon，IFN-I)转录并产生IFN-β，同时DDX3亦为IKKε/TBK1复合物的重要组成部分[17,49-51].DDX3同HCV、HIV-1、HBV、甲型流感病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒和西尼罗河病毒等多种病毒密切相关.全基因组遗传筛选结果表明DDX3是HCV感染的宿主因子，对HCV复制极其重要[52].对于HIV-1，DDX3作为其辅助因子，能携同CRM1介导HIV-1 Rev RNA的核输出并促进mRNA的翻译[28].在HBV中，DDX3能结合并抑制HBV的DNA聚合酶/逆转录酶，从而减少HBV的复制[53].近期通过免疫沉淀实验发现，作为一种抗病毒蛋白，DDX3可与甲型流感病毒NS1和NP蛋白相互作用，发挥抗病毒作用，DDX3与日本脑炎病毒5′和3′非翻译区结合调控病毒感染[54-55].近期还发现了DDX3的N端能相互作用于登革热病毒衣壳，且可能与该病毒感染后期存在联系[56].总之，研究人员明确了DDX3是一种有效的抗病毒蛋白，并将其作为许多病毒的治疗靶点，靶向DDX3研究有效的抗病毒药物能为HIV等流行病提供解决方案.

4 DDX3的生物学作用

4.1 参与RNA活动

RNA诸多代谢活动均有DDX3参与，包括RNA转录和剪接、mRNA转运和翻译等.DDX3参与RNA转录表现在对转录因子的影响，涉及的转录因子包括上文所提及的Snail1、IRF3、IRF7和SP1[34,46,49].在DDX3的C端，富含精氨酸-丝氨酸的RS结构域能与核出口因子Tip相关蛋白(tip-associated protein，TAP)相互作用，而TAP能直接结合mRNA继而介导mRNA输出，TAP还有助于mRNP(信使核糖核蛋白，包含蛋白质、snRNA和mRNA)核出口，故DDX3可参与mRNA的转运[57-58].斑点印迹分析法结果发现DDX3能与N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)的去甲基化酶烷基化修复同源蛋白5相互作用并影响其活性，通过调节mRNA的去甲基化发挥对mRNA的修饰作用[59-60].HCV核心可同DDX3的C端(氨基酸553-622)结合，HCV核心的N末端(氨基酸1-59)介导它们的相互作用，这种相互作用的影响被认为是HCV的mRNA剪接，转录和翻译调控的操纵，最终影响HCV复制[61-62]. 质谱分析结果发现DDX3能依赖外显子连接复合体与剪接的mRNA相结合，剪接因子还有其RS结构域，故DDX3可能有助于RNA 剪接[63].DDX3也是胞质应激颗粒的组成部分，暗示了DDX3在翻译调控中的作用[64].事实上，DDX3能与eIF4E及其他几种翻译起始因子包括eIF3，eIF2a，eIF4a，eIF4G和poly(A)结合蛋白1(Poly(A)-binding protein 1，PABP1)相互作用，增强含有结构化的5’非翻译区的mRNA翻译，其他研究则发现DDX3可与eIF3和40S核糖体相互作用以支持功能性80S核糖体的组装，此外，DDX3还能通过与Tat蛋白交互增强病毒mRNA翻译[26,65-69]；同时DDX3也能充当翻译抑制因子，双顺反子报告表明DDX3将eIF4E捕获于翻译非活动复合物中以阻滞与eIF4G的交互，从而抑制了Cap依赖性翻译[26].

4.2 调节细胞周期

DDX3同样对细胞周期发挥着重要的调节作用.既往发现DDX3定位不仅与CRM1相关，同时会随细胞周期的进程而变化，G0期定位于细胞核，而G1/S期则主要定位于细胞质，其定位的改变是同生物学功能相对应的[70].在有丝分裂的前期或中期，细胞核内DDX3积累增加，此现象可能与其在有丝分裂期间中心体调节和染色体分离有关，Pek等[71]提示DDX3在HeLa细胞的前期或前中期定位于接近染色体聚集的位置[72]；Chen等[73]经免疫荧光实验发现DDX3与中心体共定位；Brennan[72]的图像还提示DDX3在有丝分裂中期至胞质分裂期间与纺锤体相关联，此外 DDX3与中心体相关的p53共定位，DDX3下调致染色体错位、分离缺陷和多极有丝分裂,并造成G2/M延迟和细胞死亡等均佐证了此观点[73].与Chen等[73]的研究一致，Brennan等[72]的研究也显示，敲除DDX3会明确减缓细胞周期G2/M期的进展，这表明可能需要增加DDX3的表达和核积累，细胞才能顺利通过G2/M期的进展.起初人们发现在DDX3敲低的细胞中，细胞周期加速并提早向S期过渡，此过程伴随着细胞周期蛋白D1(G1早期至中期的调节剂)的增加[74].进一步研究表明，过表达的DDX3会提高p21并下调细胞周期蛋白D1，导致S期阻滞，DDX3的Q基序上的苏氨酸204被细胞周期蛋白B/cdc2磷酸化，导致DDX3的调节功能丧失[75-76].然而，细胞周期蛋白B的翻译尤其取决于DDX3的水平[77].此外，DDX3亦可通过促进细胞周期蛋白E1的翻译调控细胞周期[78].最新研究也认为，DDX3的抑制作用会对所有阶段的细胞产生影响，并导致细胞周期的整体进程延迟[6].

4.3 调节细胞凋亡

细胞凋亡为细胞生命重要的进程，受多方面各个因素的调节，DDX3是众多调节分子中的一员.现有研究表明，DDX3能抑制细胞凋亡，既可调控外源性凋亡信号，亦能选择性调控内源性凋亡信号.2D凝胶位移和质谱分析表明，DDX3被鉴定为TNF相关凋亡诱导配体受体2(TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 2，TRAIL-R2)相关蛋白，TRAIL-R2信号转导涉及DDX3的解离，此过程抵消了死亡信号.DDX3还与死亡受体、糖原合成酶激酶-3 (serine protein kinase 3，GSK3)和细胞凋亡抑制蛋白-1 (Cellular inhibitor of apoptosis protein 1，cIAP-1)形成死亡拮抗复合物，调控外源性凋亡信号抑制凋亡[79].研究表明，百草枯可能通过上调死亡受体5和抑制抗凋亡蛋白DDX3/GSK3来诱导外源性细胞凋亡途径，进而减少抗凋亡复合物的产生，为抵抗百草枯肺毒性提供了可能途径[80].DNA损伤后，内源性凋亡信号可被DDX3选择性调控.在无功能p53或表达突变的细胞中，DDX3通过抑制半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)而抑制细胞凋亡；相反，在p53野生型表达的细胞中，DDX3通过促caspase-7结合p53，增加p53在胞内的积累，正向调节喜树碱诱导的凋亡信号[8].在DDX3不表达的情况下，Caspase-6和Caspase-9激活被阻断，从而可保护DDX3敲低细胞不受细胞凋亡的影响[26].综上，DDX3在细胞凋亡的调节中既能抗凋亡，亦能促凋亡.

5 总结与展望

众多研究不断加深着对DDX3的认知，它在多种生理病理进程中发挥着极其重要的作用.研究主要通过实验探究DDX3的作用，多在质粒构建、细胞转染、蛋白印迹法、免疫组化分析和荧光素酶报告分析等技术上增减或按研究进行改进，但也会出现部分相反的结果，例如促癌与抑癌，因此，在进行研究时更应关注实验的限定条件，准确的条件限制能得到更为准确的结果，更加明确DDX3的病理生理学作用.

DDX3可调控肿瘤、病毒感染等疾病的发生发展，具有促进或抑制癌细胞发生发展的双重作用，目前被认为是癌症的治疗靶点.DDX3的抗病毒功能及本身的生物学特性，使HIV、HCV等全球性传染性疾病的治疗有了新的途径.因此研发DDX3抑制剂靶向相关疾病的治疗，是DDX3公认的研究方向.迄今为止，人们通过对DDX3病理生理学的研究已经研发出了RK-33、FE-15、NZ51、酮咯酸盐、阿霉素等多种抑制剂[81-84].例如应用最多的RK-33能结合DDX3的ATP结合域，从而阻断其在肺癌、尤文氏肉瘤、乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌细胞中解旋酶的活性，同时RK-33可使高表达DDX3癌细胞的细胞周期G1停滞和细胞凋亡[85-89].因此，对于DDX3高效抑制剂的开发是未来长期内的突破点，同时抑制剂的研发方法也值得深入探究.最新的DDX3抑制剂被应用在抗病毒感染中，提示进一步研发相关制剂调控DDX3也是病毒类疾病的有效治疗途径[54,90].除此之外，DDX3是否参与各类新型病毒的感染与复制，是否可成为治疗靶标，值得进一步探讨.

DDX3对细胞周期、细胞凋亡的作用提示，靶向调控DDX3以抑制癌症细胞周期增殖或促进癌细胞凋亡，能为癌症的治疗提出新方案.目前，关于DDX3翻译后修饰的研究较少，而DDX3本身具有众多潜在的翻译后修饰位点，故通过翻译后修饰调控DDX3的活性及功能可能为相关疾病的治疗提供可靠途径.分布广泛且参与细胞各项生命活动的DDX3是值得被研究的，尽管已经有了许多研究成果，但因其具有双刃剑的特性，故需要更加精准的研究以明确其病理生理学作用，从而为与DDX3相关的疾病治疗提供更加可靠的策略.