增生性瘢痕的分子生物学研究进展

李俊杰 刘凯

【提要】 尽管目前临床上针对增生性瘢痕已有了一些较为有效的治疗措施，在治疗效果上也取得了长足的进步，但因其发病机制尚未完全明确，因此仍存在较多问题。本文就增生性瘢痕的基础分子生物学研究进展进行综述，旨在为进一步认识、治疗增生性瘢痕提供参考。

伤口愈合是一个复杂的过程，包括止血、炎症、细胞增殖与再上皮化、组织重塑4个阶段[1]。受伤后，人体的血液凝固系统被激活，血小板与胶原蛋白相关的级联反应开始止血[2]。炎症阶段中，受损组织与活化的血小板一起通过募集免疫细胞(如嗜中性粒细胞和巨噬细胞)引起炎症反应[3]。这些免疫细胞的主要作用是清除伤口的细菌与碎屑。当炎症逐渐消退时，出现新的血管和结缔组织，标志着增殖阶段的开始。在该阶段，伤口面积由于伤口收缩而缩小。同时有光泽的深红色肉芽组织形成，并逐渐形成新的血管。再上皮化这一过程在该阶段起着至关重要的作用，上皮细胞从伤口床或伤口边缘逐渐延展并最终覆盖伤口。之后，就进入了组织重塑阶段。该阶段主要涉及新生血管的衰退与细胞外基质的重建。伤口愈合的每个阶段都需要复杂的协同作用及多个细胞群体的调节。干扰其中任一过程都可能导致伤口愈合的失败，造成伤口的不愈合或过度的瘢痕组织形成[4-5]。

瘢痕与正常皮肤不同，主要由结构异常和过度密集堆积的胶原纤维组成，并且伴有毛囊与腺体的缺失[6]。病理性瘢痕分为增生性瘢痕和瘢痕疙瘩[7-8]。增生性瘢痕是在皮肤受到物理损伤的部位产生过多的胶原组织，这些组织仍保留在原始病变的边界内。增生性瘢痕又可以分为线性增生性瘢痕和广泛增生性瘢痕。线性增生性瘢痕通常是由于手术或局部创伤而引起的，而广泛增生性瘢痕可能是大面积烧伤或软组织感染的结果。与增生性瘢痕不同，瘢痕疙瘩涉及过度增生的瘢痕组织，其特点是瘢痕扩展超出了初始病变的范围。瘢痕疙瘩在治疗后消退的机会很小，复发的机会很高。瘢痕疙瘩又可以分为小型瘢痕疙瘩(瘢痕超出初始病灶边界的距离小于0.5 cm)和严重型瘢痕疙瘩(瘢痕超出初始病灶边界的距离超过0.5 cm)[5]。增生性瘢痕和瘢痕疙瘩在组织学上也存在着差异，增生性瘢痕内Ⅲ型胶原纤维结构良好，而瘢痕疙瘩中则存在Ⅰ型和Ⅲ型胶原束的紊乱。鉴于瘢痕疙瘩动物模型的缺乏[9]，关于病理性瘢痕的基础研究主要集中在增生性瘢痕上。

增生性瘢痕的研究主要聚焦在成纤维细胞以及肌成纤维细胞上，前期的研究已确认这两种细胞是增生性瘢痕病理形成过程中主要的效应细胞[10-11]。其生物学行为的改变，如增殖、迁移、收缩等能力的变化，都可以在创伤愈合中对细胞外基质的形成与重塑产生重要的影响，从而导致增生性瘢痕的形成[12-14]。长期以来，关于增生性瘢痕的研究局限在成纤维细胞、肌成纤维细胞中TGF-β/Smad信号通路、Wnt/β-catenin信号通路、PI3K/AKT/mTOR信号通路、Hippo信号通路、Notch信号通路和 Hedgehog信号通路等经典作用通路上[15-16]。近期开展的一些关于增生性瘢痕的研究，不仅将之前的基础研究进行了深入与拓展，还将目光聚焦在了其他细胞对增生性瘢痕的机制研究上。本文将主要针对这两部分研究进行综述，以期为增生性瘢痕的临床治疗提供新思路。

1 成纤维细胞相关基础研究进展

1.1 表观遗传对成纤维细胞的影响

成纤维细胞活化成肌成纤维细胞是增生性瘢痕发展过程中不可缺少的步骤。研究表明，在体外培养数代后，增生性瘢痕或瘢痕疙瘩组织中提取的原代肌成纤维细胞的特定特征仍然可以保持，这表明肌成纤维细胞具有“记忆力”，这可能是由表观遗传修饰所介导，这些表观遗传修饰的存在维持了肌成纤维细胞的活化表型。表观遗传学通常通过DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNA调控等来调节基因表达。

DNA的CpG岛区域的甲基化修饰是导致基因沉默的重要机制之一，关于成纤维细胞的研究发现，与纤维化密切相关的α-SMA蛋白的调控基因ACTA也受到该过程的调控[17-19]。在Ⅱ型肺泡上皮细胞中，ACTA基因调控区和内含子区的3个CpG岛高度甲基化，α-SMA表达受到抑制。在肺成纤维细胞中，用甲基化抑制剂5'-硫唑嘌呤-2'-脱氧胞苷处理后，ACTA基因的甲基化水平被下调，基因转录被激活[20]。在纤维化期间，除ACTA基因外，DNA甲基化还可以修饰多种基因。在源自硬皮病的成纤维细胞中，Smad7或FLI-1(ECM合成抑制基因)也被高甲基化沉默，这表明DNA甲基化可能使抑制ECM合成的基因沉默，从而导致皮肤纤维化[18,21]。研究发现，使用小分子干扰RNA技术抑制成纤维细胞中DNA甲基化转移酶的表达，可导致ACTA基因的转录激活[19,22-23]。上述研究提示，有可能通过特异性控制纤维化和抗纤维化基因的甲基化水平来治疗增生性瘢痕及其他纤维化相关疾病。

组蛋白修饰发生在整个增生性瘢痕形成过程中。通常，组蛋白修饰对于增生性瘢痕相关基因如ACTA等的调控是间接性的[24-25]。组蛋白去乙酰化酶4、6和8(HDAC 4、6和8)是组蛋白修饰的重要调控因子。研究发现，HDAC4可能会影响TGF-β1诱导的成纤维细胞分化信号通路中AKT蛋白的激活，但是这些组蛋白去乙酰化酶对纤维化相关靶基因的直接作用尚未阐明[26]。研究表明，组蛋白乙酰化通常与增生性瘢痕相关靶基因的激活有关。因此，研究认为可以通过增加一些ACTA抑制基因启动子区域的乙酰化，来实现对ACTA基因表达的抑制[27]。除组蛋白乙酰化外，研究还发现组蛋白甲基化也参与了成纤维细胞的激活以及纤维化的形成过程[28]。目前，在皮肤伤口愈合模型中，在再生性和非再生性伤口之间检测到不同的组蛋白乙酰化模式，探索组蛋白乙酰化促进伤口愈合与皮肤再生、抑制增生性瘢痕形成的具体机制，可能是今后研究的方向。

近年来的研究发现，各种miRNA能通过调节TGF-β/ Smads等经典增生性瘢痕进展相关通路，干扰上皮间充质转化、细胞外基质的合成和降解等过程[29-30]。研究还发现，瘢痕组织中的miRNA表达模式与正常组织中的不同。miR-132参与纤维化并通过抑制MeCP2[31]表达和降低PPARγ表达间接增强了成纤维细胞中ACTA基因的表达。let7和miR-21也可分别通过激活HMGA2和Smad7间接影响成纤维细胞的激活，即肌成纤维细胞的形成[32-33]。miR-143-3p和miR-27b均可通过抑制细胞外基质的表达，起到预防增生性瘢痕的发生与发展的作用[34-36]。此外，研究发现，一些miRNA可以通过影响经典的增生性瘢痕相关信号通路来促进纤维化。大量研究表明，成纤维细胞中的miR‐29是影响纤维化的核心miRNA。在硬皮病患者皮肤活检样本提取且体外培养的成纤维细胞中，miR‐29表达显著降低。同时，肺成纤维细胞中miR-29的敲低或下调可以在体外激活纤维化相关基因。更多证据表明，心脏成纤维细胞中miR-29的下调可以在体内和体外诱导纤维化相关基因的表达，而其高表达可以抑制纤维化[30,37]。同时，大量的研究也证实，miRNA能通过干扰TGF-β信号通路影响增生性瘢痕的进程[38-39]。如miR-140-5p能下调TGF-β II受体的活性，而miR-23b和let-7 g则上调TGF-β II受体的活性。临床数据证实，miR-17-5p和miR-20对TGF-β II受体活性的调节还影响着增生性瘢痕的进程[40-41]。除了这些核心miRNA，还有miR-4269、miR-27、miR-203、miR-205、miR-150和miR-196a等多种miRNA被认为会影响TGF-β1信号通路对胶原蛋白合成的调节过程[35,42-44]。基因芯片分析显示，相较于正常皮肤组织，增生性瘢痕组织中有152个miRNA有明显表达差异，其中包括82个上调的miRNA和70个下调的miRNA。这些研究结果均表明，miRNA可能成为治疗增生性瘢痕的新分子靶标[45]。

1.2 不同成纤维细胞分型对增生性瘢痕的作用

研究发现，皮肤成纤维细胞起源于胚胎的不同位置，特定的位置来源具有同一性。例如，面部的成纤维细胞是由神经嵴产生的，而背侧皮肤则不是[46]。人体不同部位皮肤的成纤维细胞在蛋白质合成和对细胞因子的反应上存在差异。近年来，随着空间转录组及单细胞测序等技术的发展，通过结合空间和单细胞转录谱，证实了成年人类皮肤中不同成纤维细胞亚群的存在[47]。这些真皮成纤维细胞群体在正常和创伤状态下的细胞分裂、分化、收缩、蛋白酶和细胞因子/生长因子的分泌，及其对这些因子的反应等各种生物学行为上都表现出根本的差异。

乳头状成纤维细胞位于真皮乳头层中。这些细胞表达更高水平的FAP、CD36、CD39、Netrin1和Podoplanin，且不能直接分化为脂肪细胞[48]。与网状成纤维细胞相比，乳头状成纤维细胞显示出较低的收缩性。细胞中蛋白聚糖、核心蛋白聚糖和血小板反应蛋白合成较多，胶原蛋白合成较少[49]。乳头状成纤维细胞能够支持表皮干细胞生长，并促进器官3D培养中表皮的形成和存活。在伤口愈合期间，乳头状成纤维细胞主要参与免疫反应、伤口重塑和新的毛囊形成。乳头状成纤维细胞仅在创伤愈合中再上皮的形成期间被募集。这些细胞产生一个松散的细胞外基质网络，该网络支持毛囊和其他皮肤附件的形成，并允许上皮-间质之间的相互作用，该过程对于无瘢痕愈合至关重要。因此有研究认为乳头状成纤维细胞具有抗纤维化的特性[47,50]。

网状成纤维细胞位于真皮网状层中，具有特定的表达标记物，包括MGP、TGM2、MFAP5、CD26、CD36、CD90等。此外，网状成纤维细胞胶原VIA5表达阴性[50]。与乳头状成纤维细胞相比，这些细胞具有较强的收缩性，并且能够成脂分化。在培养中，与乳头状细胞相比，网状成纤维细胞产生更多的胶原蛋白、蛋白聚糖、TGF-β1和α-SMA，较少的核纤维调节蛋白、胶原酶和TGF-β3[51]。在网状成纤维细胞上培养的角质形成细胞具有不规则形状，并且不能形成完全分层的表皮。网状成纤维细胞是参与人类皮肤伤口愈合的主要成纤维细胞。研究显示，在伤口床上，最丰富的间充质干细胞是表达CD26的脂肪细胞前体细胞，其次是皮肤伤口愈合过程中的网状成纤维细胞CD29+亚群[52]，并共同介导伤口修复的早期阶段，包括肉芽形成和伤口收缩。这些成纤维细胞细胞显示出形成瘢痕的能力，这种能力由涉及皮肤深处的损伤所证实，常常导致增生性瘢痕或瘢痕疙瘩的形成。

1.3 成纤维细胞与炎症

由于伤口床上活化的成纤维细胞是细胞外基质的主要生产者[53]，因此之前的研究主要就成纤维细胞在组织修复的增殖和重塑阶段的作用进行了广泛的论证。最近的发现表明，成纤维细胞在组织炎症中也起着重要的作用。损伤后，成纤维细胞会分泌炎症因子导致早期炎症并在多种组织(如皮肤、肺、肝、肠、心脏、结膜、泌尿生殖道和脂肪组织等)中引起损伤反应[54-56]。这些促炎性的成纤维细胞通常通过募集和激活髓样细胞来刺激免疫反应。炎症消退后，成纤维细胞主要介导细胞外基质沉积。这些研究表明，成纤维细胞具有类似于巨噬细胞和角质形成细胞的促炎作用。虽然直接研究体内真皮成纤维细胞与免疫细胞之间的相互作用尚处于初期阶段，但成纤维细胞所具有的炎性本质在其他组织中得到了证明。

来自多个器官的小鼠成纤维细胞的多组学测序表明，这种之前所认为的结构细胞的免疫功能尚未得到充分认识[54]。真皮成纤维细胞的转录组及随后的转座酶可及性染色质分析(ATAC)证明了真皮成纤维细胞中多个免疫基因位点的转录潜能，其中就包括干扰素γ受体。此外，另一项研究针对健康人皮肤的成纤维细胞和炎性疾病(痤疮、斑秃、环形肉芽肿、麻风病和牛皮癣)的样品进行了单细胞测序(scRNA-seq)，结果表明成纤维细胞中许多免疫基因在多个簇群中上调，例如CCL2、CCL19、CXCL12、CXCL14、IL6和IL8/CXCL8等[57]。这些研究突出了皮肤成纤维细胞的促炎能力。更有趣的是，来自银屑病患者的成纤维细胞的蛋白质组学分析证实，其炎症相关蛋白(如TNFα)的水平更高[58]，来自银屑病成纤维细胞的上清液诱导了炎性巨噬细胞表型[59]。另外，来自特应性皮炎患者的成纤维细胞在培养的皮肤等同物中诱导炎症基因表达。同样，在创伤后的小鼠和人皮肤中，在真皮网状层的成纤维细胞内观察到促炎基因的表达谱，这说明特定成纤维细胞群可能存在炎性倾向[60]。这些发现不仅暗示了成纤维细胞作为损伤反应的早期响应者的促炎作用，而且还突显了细胞多样性在伤口愈合过程中推动差异性炎症反应的可能性。

2 其他细胞相关基础研究进展

尽管伤口愈合的潜在机制十分复杂，但研究发现炎症是其决定因素之一。炎症除了传统的抗伤口感染的作用外，还对病理性瘢痕的发病机理产生了巨大的影响。增生性瘢痕的特征之一在于持续的局部炎症和过多的胶原蛋白沉积。因此，越来越多的研究聚焦于炎症细胞与增生性瘢痕相关的研究上。了解炎症细胞在创伤修复中的作用与机制，将有助于深入了解增生性瘢痕形成的机理，并促进开发有效的治疗方法。

2.1 肥大细胞与增生性瘢痕

肥大细胞被认为是一种促进成纤维细胞活化和过度胶原沉积的炎症细胞类型。肥大细胞参与伤口修复过程。关于动物和人类伤口的研究表明，肥大细胞会因皮肤损伤而发生脱颗粒作用，并且在创伤修复过程中肥大细胞数量会增加，这很可能是由于循环中募集了肥大细胞前体所致。研究表明，肥大细胞在伤口修复过程的每个阶段都起作用，包括炎症、增殖和肉芽组织形成/重塑阶段。

近期的研究表明，与正常皮肤相比，增生性瘢痕组织中的组胺含量明显增加，表明增生性瘢痕组织中存在活跃的肥大细胞[61]。与对照组相比，增生性瘢痕患者中过敏症状的发生率也有所增加。与没有瘙痒性疾病的患者相比，有瘙痒性皮炎的烧伤患者的肥大细胞和瘢痕严重程度更高[62]，这表明肥大细胞的活化在瘢痕形成中起着一定的作用。与正常皮肤、肉芽组织或成熟的瘢痕组织相比，增生性瘢痕组织中的肥大细胞数量更多[63-64]。此外，研究表明，各种减少增生性瘢痕真皮厚度的治疗方法会导致真皮层肥大细胞数量的减少[61]。动物模型研究发现，与正常皮肤相比，猪的增生性瘢痕组织显示出更多的肥大细胞染色[65]。同时，肥大细胞稳定剂酮替芬治疗可减少猪伤口收缩和胶原蛋白沉积，形成更薄和密度较小的胶原蛋白原纤维[66]。关于小鼠力学负荷诱导的增生性瘢痕模型，以及裸鼠人增生性瘢痕皮肤移植诱导模型的研究均表明，肥大细胞在增生性瘢痕病变组织中明显增加[65,67-68]。

此外，之前的研究发现，胎儿的皮肤能够在发育的3个月内实现无瘢痕愈合，大量研究表明，无瘢痕愈合的胎儿伤口几乎没有炎症；随着胎儿皮肤系统变得更加完善，其无瘢痕愈合的能力逐渐丧失。据报道，与成熟皮肤(成人)相比，妊娠中期胎儿皮肤(18～22周)含有更少的肥大细胞[69]。除了在发育过程中肥大细胞密度增加外，肥大细胞在大小、颗粒密度和颗粒的生化组成方面也变得更加成熟[62,69]。总之，肥大细胞数量的改变、肥大细胞成熟度的改变、肥大细胞脱颗粒程度的改变，均是影响增生性瘢痕形成的重要因素。

2.2 巨噬细胞与增生性瘢痕

大量研究表明，巨噬细胞能够参与整个创伤愈合的过程，并且在增生性瘢痕发展过程中起着重要的作用。目前，关于巨噬细胞与增生性瘢痕的进展研究主要集中在巨噬细胞的极化领域。研究发现，在不同的微环境作用下，巨噬细胞可以极化为两种主要的表型，即M1型与M2型巨噬细胞。在伤口愈合的过程中，M1巨噬细胞通过杀死病原体和清除细胞碎片来启动炎症期，M2型巨噬细胞则主要参与增殖和重塑阶段[70]。

在IFN-γ、TNF-α、DAMP和LPS的存在下，单核细胞极化成经典的M1型巨噬细胞。这些具有促炎作用的M1型巨噬细胞能够分泌细胞因子，例如IL-1β、IL-6和TNF-α[71]，它们不仅参与伤口周围的免疫反应，而且还能够刺激成纤维细胞和角质形成细胞的增殖。这些M1型巨噬细胞的主要功能是清除伤口上的细胞碎片[72]。在正常组织修复过程中，早期以M1型巨噬细胞分泌的细胞因子高表达为标志。研究表明，M1型巨噬细胞的数量在伤后0～2 d开始增加，在伤后7～14 d达到峰值，并在伤后14～28 d显著下降。研究发现，伤口愈合过程中巨噬细胞极化的不平衡会导致增生性瘢痕的形成[73]。增生性瘢痕中，包括IL-6和CCL2在内的M1型巨噬细胞分泌的炎症蛋白水平，明显低于正常瘢痕组织。此外，相对于正常组织而言，增生性瘢痕中促炎细胞因子的水平，例如TNF-α、CCL-2和IL-1β都很低[74]。因此，早期M1型巨噬细胞极化的减少及炎症阶段的减弱，可能导致增生性瘢痕的形成。

研究发现，与正常瘢痕相比，增生性瘢痕的进展与M2型巨噬细胞及其产生的抗炎细胞因子的延迟和延长表达有关。通常，M2型巨噬细胞在损伤后第4周显著增加，并在第8周恢复基线水平[75]。如果M2型巨噬细胞的数量保持较高水平，则会导致增生性瘢痕。Van den Broek等[74]研究发现，形成增生性瘢痕的患者在损伤后第4～6周才能检测到CD163+的M2型巨噬细胞，而形成正常瘢痕的患者则仅仅需要2周即可检测到。将人类增生性瘢痕皮肤移植到裸鼠上建立增生性瘢痕移植模型，发现M2型巨噬细胞(F4/80+和Arg-1+)和特定的细胞因子IL-10、IL-1α显示出延迟的表达[76]。更深入的研究表明，M2型巨噬细胞可进一步细分为M2a、M2b、M2c和M2d型[77]。虽然目前关于增生性瘢痕中巨噬细胞的研究仍主要集中在巨噬细胞的分布和数量上，但是上述这些开拓性的新进展提示我们，对巨噬细胞极化及亚型的进一步探索或可找到新的针对增生性瘢痕的有效治疗方法。

3 小结与展望

增生性瘢痕一直是临床上亟待解决的难点与重点。但由于其发展过程错综复杂，参与其中的细胞类型繁多，其发病机制还未完全阐明。本文回顾了近期开展的一些关于增生性瘢痕的新研究，将成纤维细胞相关的基础研究进行了更深入细致的探讨，并且还阐述了肥大细胞、巨噬细胞与增生性瘢痕相关的新进展。这些影响增生性瘢痕形成的细胞之间的相互作用还有待进一步研究。希望能够随着基础研究的深入与进步，减少病理性瘢痕的形成，最终实现临床上皮肤无瘢痕愈合的最终目标。