间充质干细胞源性外泌体对骨性关节炎治疗机制的研究进展

郭天赐 刘爱峰 陈继鑫 余伟杰

【提要】 骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)是好发于多个年龄段的常见骨关节病，伴有软骨损伤及局部炎症反应等复杂的病理改变。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)具有较强的抗炎、组织修复及免疫调节的能力，而间充质干细胞经旁分泌途径分泌的外泌体(Exosome)在组织修复与软骨再生方面具有重要作用。研究发现，MSCs源性外泌体能够通过转运并释放蛋白质、非编码RNA等生物活性物质，介导并传递抗炎及免疫活性因子，缓解OA病理进程，促进软骨修复与再生，但其具体作用机制仍不明确。本文对MSCs源性外泌体在OA治疗中的相关机制研究结果进行综述，以期为OA的临床治疗提供新的方向。

骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)是最常见的退行性骨关节病，好发于膝、髋、颈、腰等负重关节及指间、跖趾等小关节，以关节软骨和软骨下骨退行性改变为特征，常累及整个关节[1-2]。研究显示，60岁以上的人群中9.6%的男性和18.0%的女性有OA的症状[3]。OA的发病机制尚未完全阐明，但已发现OA的病理机制涉及NF-κB、Wnt/β-catenin等细胞信号通路以及巨噬细胞自噬清除、多种转录因子(Transcription factors，TCF)和miRNA的调控，还涉及TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10等促炎与抑炎因子的失衡等[4-5]。OA的病理涉及软骨、软骨下骨在内的整个关节，现已证明软骨细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的合成和降解失衡是骨关节炎的典型病理特征[6-8]。

临床中OA的治疗手段有很多，尽管手术和药物治疗能够一定程度上缓解疼痛，但无法从根本上解决关节软骨的再生和修复问题。间充质干细胞具有强大的软骨再生和修复能力，具备向软骨细胞分化的能力和免疫调节特性，成为目前研究最广泛的OA细胞治疗方法[9-10]。大量研究表明，MSCs分化成软骨细胞、参与组织修复的功能主要依靠其旁分泌途径来实现的，其分泌的外泌体在其中可能起着关键作用[11]。Toh等[12]认为，MSCs分泌的外泌体也可以在治疗OA中发挥积极作用，因其含有丰富的蛋白质和ECM酶，可以调节和恢复ECM平衡。由于外泌体拥有更高的稳定性和免疫原性，无细胞毒性，可减少干细胞移植所带来的免疫反应，更易用于临床治疗[13]。因此，MSCs来源外泌体作为“无细胞”治疗手段用于OA治疗日趋受到关注[14]。MSCs源性外泌体在OA治疗中的具体作用机制目前尚无定论。本文就MSCs源性外泌体治疗OA的具体作用机制及最新研究进展进行综述。

1 外泌体的相关概述

1.1 外泌体生物学特性

外泌体是一种直径为30～150 nm的双层微小膜结合囊泡，可由多种细胞释放[15]。以“内吞-融合-传递”的方式释放至细胞外基质中。外泌体内包含了多种RNA、mRNA、miRNA、DNA和功能性蛋白质等生物活性物质，能够介导细胞间多种信号传递和交流，具有抗炎、修复受损组织等作用[16]。外泌体来源于胞质膜内吞作用所产生的内体。随后，在细胞内部，诸如mRNA或蛋白质之类的生物活性物质聚集在内小体内，从而形成多囊内体或腔内小泡。进一步加工后，外泌体最终通过膜融合释放[17-18]。这些微囊泡参与了细胞间信息传递的过程，在生物体细胞间的通信交流中起到极其重要的作用。此外，外泌体还可作为稳定的载体，将自身携带的蛋白质、脂质和核酸(包括miRNA和长的非编码RNA)等生物活性物质特异性输送到靶细胞中，在细胞间通信和细胞免疫反应中发挥着重要作用[19]。

1.2 外泌体的软骨修复作用

近年来，MSCs源性外泌体在修复损伤组织及软骨再生方面的作用已成为研究热点。MSCs来源外泌体内富含大量的蛋白质和miRNA，能够直接与受损组织细胞进行信息交流，对受损细胞进行生物学功能调控。因此，MSCs源性外泌体在OA软骨修复与再生方面的作用机制也成为了研究的焦点。目前的研究表明，各种MSCs-Exo均可促进软骨细胞的增殖，加快软骨的修复与再生[2]。此外，研究发现，外泌体不会被免疫系统识别。外切体的免疫原性可能与其表面黏附蛋白和载体配体有关，但具体作用机制尚不清楚。Kordelas等[13]对1名有移植物抗宿主病患者2周内多次静脉输注MSCs来源的外泌体，结果耐受性良好，没有引起不良反应。Zhang等[20]将人胚胎间充质干细胞异种移植到免疫活性动物体内进行软骨修复，立即引起不良组织反应，导致修复效果不佳。这也表明MSCs来源外泌体具有无细胞毒性且免疫排斥反应小的特点。

1.3 外泌体的抗炎与免疫调节作用

关节腔内局部生长微环境是软骨修复与再生的关键，外泌体具有抗炎作用，参与免疫调节，可抑制OA进展[21]。外泌体能够减少TNF-α、IL-6等促炎因子的含量，增加抗炎因子IL-10的表达，这可能与NF-κB通路有关[22]，且能够抑制TNF-α等引起的炎症反应，如促炎因子白介素及环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)的表达。然而，研究发现，缺乏外泌体的间充质干细胞对COX-2表达的抑制作用明显减弱。这说明外泌体在间充质干细胞抗炎旁分泌途径中扮演着重要角色。为进一步诠释外泌体的抗炎作用，Vonk等[23]检测NF-κB亚单位P65的亚细胞定位情况，发现经TNF-α处理后可引起P65由细胞质易位到细胞核，继而诱使NF-κB 通路激活。进一步研究证明，外泌体能抑制NF-κB的亚单位IKBα的磷酸化，进而阻断NF-κB通路的激活，表明外泌体的抗炎作用与抑制NF-κB信号通路相关。此外，Zhang等[24]研究发现，外泌体具有免疫调节作用，可减少M1巨噬细胞的渗入，抑制促炎因子IL-1β和TNF-α的表达，促使M2巨噬细胞大量渗入OA骨缺损及滑膜病变处，发挥其抗炎作用，分泌血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial cell growth factor，VEGF)、IL-10、TGF-β等抑炎因子，有利于软骨的修复与再生。综上所述，MSCs源性外泌体展现出潜在的抗炎与免疫调节能力，达到抗炎免疫与组织重建之间的平衡。

2 多种MSCs源性外泌体在OA治疗中的应用机制

2.1 BM-MSCs源性外泌体在OA治疗中的应用

近年来，基于BMSCs的治疗被认为是组织修复的新疗法[25]。大量研究发现，BMSCs通过其分泌的外泌体介导组织修复，参与了软骨修复的调节[26]。Ju等[27]发现，MSCs-Exo在促进软骨增殖、修复和增生，维持软骨稳定性和抑制软骨降解方面具有显著作用。Wang等[28]发现，外泌体来源的miR-135B可以下调软骨细胞Sp1的表达。进一步研究发现，通过转化生长因子-β-1刺激BMSCs，使得miR-135B在MSCs-Exo中的表达增强，细胞活力提高，Sp1的表达降低，提示转化生长因子-β-1通过刺激MSCs来源的含有miR-135B的外泌体，负调控Sp1的表达，从而促进软骨细胞的增殖，加快OA软骨的修复，这可能为OA的治疗提供新的方向。Jin等[29]发现，与注射生理盐水的大鼠相比，注射外泌体的大鼠关节软骨组织中mRNA和蛋白的表达降低；同时，OA大鼠关节液中注射外泌体miR-9-5p会导致IL-1、IL-6和TNF-α等促炎因子含量降低。因此，推测外泌体miR-9-5p有助于抑制炎症和氧化应激损伤，BM-MSCs来源的外泌体miR-9-5p对大鼠OA有改善作用，BM-MSCs来源的外泌体能够抑制OA进展，修复软骨损伤和减轻炎症。

2.2 SD-MSCs源性外泌体在OA治疗中的应用

以往研究表明，滑膜间充质干细胞(Synovium-derived mesenchymal stem cells，SD-MSCs)具有分离方法简便，增殖能力及多分化能力较强的特点，在软骨、韧带及骨组织工程领域应用广泛。Guo等[30]通过大量体外实验结果证明，SD-MSCs外泌体可以促进BMSCs的增殖，同时具有抗凋亡能力，对糖皮质激素诱导的骨坏死有预防作用。Tao等[31]发现滑膜间充质干细胞中Wnt5a和Wnt5b高表达，并且在SD-MSCs分泌的外泌体中也富含Wnt5a 和Wnt5b。SD-MSCs分泌的外泌体通过Wnt5a和Wnt5b激活Yes相关蛋白YAP(Yes-associated protein，YAP)，激活的YAP导致软骨细胞增殖迁移，但是引起分子信号Sox9(sexdetermining region Y box 9，Sox9)表达和细胞外基质蛋白合成分泌降低。由此，进一步对Wnt信号传导和YAP活化的机制进行研究，通过添加核酸使SD-MSCs高表达miR-140-5p，并在SD-MSCs分泌的外泌体中检测到高表达的miR-140-5p。结果表明，高表达miR-140-5p的外泌体能够增加Sox9和细胞外基质分泌。因此，高表达miR-140-5p的SD-MSCs的外泌体可以缓解OA病变，在临床实践中具有巨大潜力，可用于开发研究治疗OA的药物。同时，这些结果也提示，基因技术修饰后的外泌体可能是未来OA的治疗策略之一，有着广阔的研究前景。

2.3 AD-MSCs源性外泌体在OA治疗中的应用

脂肪间充质干细胞(Adipose derived mesenchymal stem cells，AD-MSCs)来源广泛，易获取[32]。Xia等[33]研究发现，IL-6、IL-1等促炎细胞因子和NF-κB通路对OA患者的滑膜炎症和软骨破坏特征有很大影响。Zhao等[34]从AD-MSCs中分离的外泌体能够下调促炎标志物IL-6的表达，影响NF-κB通路的表达。因此，AD-MSCs-Exo能够抑制这些促炎细胞因子，具有改善OA的潜力。

Mianehsaz 等[35]发现，从AD-MSCs分泌的外泌体可以通过多种途径起到抗炎和软骨保护的作用，包括减少炎症介质(如TNF-α、IL-6、IL-1)的产生，减少基质金属蛋白酶活性的释放。Cosenza等[26]发现，MSCs来源的外泌体可以通过增加Ⅱ型胶原和聚集素等软骨细胞标志物的表达，降低炎性标志物INOS及MMP-13、ADAMTS-5等分解代谢标志物的表达，减少软骨细胞的凋亡，并阻断巨噬细胞的激活，从而保护OA的软骨和骨的降解。这些作用与促进细胞增殖和迁移可能是AD-MSCs-Exos对OA有一定保护作用的原因。

3 MSCs源性外泌体分泌miRNA在OA治疗中的应用机制

miRNA是一种非编码RNA，长度约为22个核苷酸[36]。MSCs-EXO中含有多种miRNA，其在OA的修复机制中发挥着重要作用。Sun等[37]发现，高表达miR-320C的hBMSCs来源外泌体在促进软骨细胞增殖和下调基质金属肽酶13方面更有效。Martinez-Sanchez等[38]提出，miRNA-145可以通过直接抑制Sox9来调节人类软骨细胞的功能。Wang等[28]在大鼠模型中发现，MSCs-exo衍生的miRNA-135B可通过调控TGF-b促进软骨修复。苏永蔚等[39]在实验型SD大鼠创伤性骨关节炎模型中发现，MSC-27b-Exos关节腔内注射，具有明显的抗炎作用并可减缓关节软骨退行性变。

Miyaki等[40]通过低表达miRNA-140(--/++)的小鼠模型，发现miRNA-140介导了关节软骨蛋白多糖的合成和软骨的纤维化过程，其缺失可导致退行性骨关节炎发生，而当miRNA-140高表达时可防止OA样软骨的退变，表明MSCs源性外泌体中携带的高含量miRNA-140可能成为OA潜在的治疗方式，值得深入研究。此外，Dudek等[41]证实miR-675可以调节软骨基质中Ⅱ型胶原A1(COL2A1)的表达，高表达的miR-675能够在一定程度上缓解由于Sox9基因缺失造成的COL2A1的缺乏，这可能会成为调节软骨基质生成的新途径，软骨修复的新靶点。miR-148a高表达可以降低Ⅹ型胶原A1的表达，促进COL2A1的分泌，促进软骨细胞增殖，预防OA的进展。这可能成为修复关节软骨及间充质干细胞治疗骨性关节炎的关键靶点[42]。因此，MSCs-Exo来源的miRNA不仅可以促进软骨细胞增殖，抑制软骨细胞凋亡，还能调节免疫应答。了解其特定miRNA的潜在机制及进一步探索不同基因的排列组合，可能为OA的治疗提供一些新的方向。

4 总结

OA的病理涉及软骨、软骨下骨等在内的整个关节，MSCs源性外泌体由于其独特的功能和特性，能协调骨性关节炎中的炎症介质及免疫过程，且富含大量蛋白质、miRNA等生物活性物质，对修复受损组织或充当治疗药物稳定载体具有重要作用，在OA发病机制、诊断及治疗方面拥有广阔的临床前景。今后的研究应着力于两方面。①外泌体应用于OA临床治疗的研究鲜有报道，且外泌体对人体正常细胞的作用机制尚不十分清楚，利用外泌体作为治疗药物载体值得深入研究；②有关外泌体对OA的具体作用机制尚不深入，MSCs源性外泌体在OA人体中的注射剂量也有待标准化。因此，需要进一步探究其治疗OA的可行性和安全性。相信在不久的将来，外泌体会为临床OA治疗提供新的方向。