槲皮素对胃癌相关p53∕AMPK∕mTOR信号通路的影响

李欣，林明哲，赵久达

胃癌是常见的肿瘤之一，发病原因与不良习惯及细菌感染有关［1］。槲皮素（quercetin，QE）是一种天然黄酮类化合物，具有抗炎、抗癌、抗氧化等多种作用。研究显示，QE可呈时间和剂量依赖性地抑制人肺腺癌细胞的增殖，并可能通过上调P53蛋白表达来诱导肺腺癌细胞的凋亡［2］。另有研究显示，QE可以通过促进肿瘤细胞的自噬而起到抗癌作用［3］。然而，目前有关QE对胃癌细胞的作用机制并不十分明确。有研究显示，p53信号通路是抑癌通路，可以促进肿瘤细胞凋亡；腺苷酸激活蛋白激酶（AMPactivated protein kinase，AMPK）与细胞自噬有关，也是调控肿瘤细胞的信号通路；AMPK和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路存在交叉作用，而mTOR也参与肿瘤细胞自噬过程［4］。目前，关于p53∕AMPK∕mTOR信号通路与胃癌关系的相关研究少见。本实验旨在探讨QE对p53∕AMPK∕mTOR信号通路的影响及其抗肿瘤作用机制，以期为胃癌治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 QE购自上海同田科技有限公司。酶标仪（型号：9602；上海名元科技有限公司），流式细胞仪（型号：S3e；美国Bio-Rad Laboratories公司），荧光定量PCR仪（型号：ABI6000；美国thermo公司），Western blot湿电转膜仪（型号：E-BLOTTER；美国Protein Simple公司），恒温培养箱（型号：QP-160；济南来宝医疗科技有限公司）。人体胃癌细胞SGC-7901（美国ATCC细胞库）；DMEM培养基（上海哈灵生物有限公司）；青∕链霉素（贵州赛兰博科技有限公司）；MTT试剂盒（上海歌凡生物有限公司）；自噬检测试剂盒、凋亡检测试剂盒（美国Sigma公司）；SYBR Premix EX Taq试剂盒（武汉科昊佳生物科技有限公司）；标准胎牛血清、一抗抗体P53、AMPK、mTOR、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ及内参β-肌动蛋白（β-actin），二抗HRP-羊抗兔IgG（上海艾博抗有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养及分组 将胃癌细胞接种到制备好的培养基中，置于37℃、5%CO2温箱中培养。当胃癌原代细胞培养至第3代对数生长期时用于后续实验研究，期间各组细胞均以相同条件（37℃、5%CO2）培养。QE组以DMSO为溶剂，将QE配制成0.02、0.04、0.06及0.08 mmol∕L溶液对细胞进行干预，分别对应QEA、QEB、QEC、QED组；溶剂组加入等量不含QE的溶剂。

1.2.2 MTT实验检测细胞增殖水平 取第3代对数生长期的细胞，接种至6孔板，调整密度为2×104个∕mL，每孔100μL，在37℃温箱中培养。细胞完全贴壁后，按1.2.1分组处理细胞，每组设6个复孔，温箱培养12、24、48 h时移除孔板中的培养液，按照MTT说明书操作并检测波长490 nm处的光密度（OD490）值。计算各个时点各组胃癌细胞抑制率=（1-实验组OD∕对照组OD）×100%。

1.2.3 MDC染色法检测胃癌细胞自噬 按照1.2.1分组处理细胞后，将各组细胞培养48 h，按照自噬检测试剂盒说明书操作，并于荧光显微镜（×3000）下观察并拍照，计算积分光密度值（IOD），IOD=染色的像素点强度值累加值∕所选区域面积（A）。

1.2.4 双染法检测胃癌细胞凋亡率 取第3代对数生长期的细胞，接种于6孔板中，每孔约2×105个细胞。置于37℃、5%CO2的培养箱中，根据1.2.1将细胞分组处理，培养48 h，然后用0.25%胰酶消化细胞，1000 r∕min离心5 min，弃上清液。4℃预冷的70%乙醇固定，调整细胞浓度为1×106个∕mL，加入染色剂10 mL，置于4℃冰箱中染色30 min，流式细胞仪检测凋亡情况，细胞凋亡率（%）=凋亡细胞∕细胞总数×100%。

1.2.5 实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）检测p53、AMPK及mTOR的mRNA相对表达水平 采用Trizol提取细胞总RNA，逆转录试剂盒获得cDNA。反应体系20μL：SYBR Premix EX Taq试剂盒中的MonAmp SYBR预混液10μL，上下游引物各0.4μL，cDNA模板1μL，无核酸酶纯水8.2μL。反应条件：95℃2 min；95℃15 s，60℃45 s，45个循环；60℃45 s。U6mRNA水平作为内参对结果进行归一化。将配置好的反应体系放置在荧光定量PCR仪中进行反应。引物由上海生工合成。记录各孔Ct值，以2-ΔΔCt来计算mRNA相对表达水平。基因引物序列，见表1。

Tab.1 Primer sequences of related genes表1 相关基因引物序列

1.2.6 Western blot检测LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ、P53、AMPK、mTOR蛋白表达情况 将胃癌细胞按1.2.1分组处理，培养48 h，收集各组细胞进行蛋白提取。将样品放在沸水中加热至蛋白完全变性，取出样品冷却至室温，取30μg进行电泳，湿转至聚偏二氟乙烯膜。常温下5%脱脂牛奶封闭1 h，轻轻摇动，加入一抗anti-P53、anti-AMPK、anti-mTOR、anti-LC3-Ⅰ及anti-LC3-Ⅱ（均1∶1000）于4℃孵育过夜，磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗3次，每次10 min，加入二抗（1∶2000）常温下孵育1 h，PBS清洗3次，每次10 min，化学发光法显影处理、拍照，以βactin作为内参蛋白。Image J（v1.7.0）软件对条带进行定量分析，蛋白相对表达量=目标蛋白灰度值∕参照蛋白灰度值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t法，组内各时间点比较采用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组胃癌细胞抑制率比较 12、24及48 h时，QE对胃癌细胞的抑制率均呈浓度依赖性增高，且各组内随干预时间的延长抑制率亦逐渐增高（P＜0.05），见表2。

2.2 各组细胞自噬和细胞凋亡率比较 随着QE浓度增加，胃癌细胞自噬程度和凋亡率均呈浓度依赖性增加（P＜0.05），见表3，图1、2。

2.3 各组p53、AMPK及mTOR的mRNA相对表达水平比较 随着QE浓度增加，胃癌细胞中p53、AMPKmRNA相对表达水平均呈浓度依赖性增加，而mTORmRNA相对表达水平呈浓度依赖性降低（P＜0.05），见表4。

Tab.2 Comparison of inhibition rates of gastric cancer cells between the four groups表2 各组胃癌细胞抑制率比较（n=6，%，±s）

Tab.2 Comparison of inhibition rates of gastric cancer cells between the four groups表2 各组胃癌细胞抑制率比较（n=6，%，±s）

*P＜0.05，**P＜0.01；a与QEA组比较，b与QEB组比较，c与QEC组比较，P＜0.05；A与12 h比较，B与24 h比较，P＜0.05

组别QEA组QEB组QEC组QED组F 12 h 9.511±1.48114.621±1.532a 26.032±2.951ab 39.861±3.423abc 174.881**24 h 14.782±1.344A 27.472±3.012aA 37.823±3.402abA 54.801±1.931abcA 179.793**48 h 17.584±1.541AB 42.074±2.452aAB 60.324±3.993abAB 70.474±1.933abcAB 462.472**F 13.424*257.004**254.853**142.361**

2.4 各组LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ、P53、AMPK及mTOR的蛋白相对表达水平比较 随着QE浓度增加，胃癌细胞中LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ、P53、AMPK相对表达水平均呈浓度依赖性增加，而mTOR相对表达水平呈浓度依赖性降低（P＜0.05），见表5、图3。

Tab.3 Comparison the effects of autophagy and apoptosis rates of gastric cancer cells between the five groups表3 各组细胞自噬和细胞凋亡率的比较（n=6，±s）

Tab.3 Comparison the effects of autophagy and apoptosis rates of gastric cancer cells between the five groups表3 各组细胞自噬和细胞凋亡率的比较（n=6，±s）

**P＜0.01；a与溶剂组比较，b与QEA组比较，c与QEB组比较，d与QEC组比较，均P＜0.05；表4、5同

细胞凋亡率（%）2.642±0.3226.473±1.544a 13.413±2.273ab 23.293±3.694abc 41.685±3.415abcd 224.093**组别溶剂组QEA组QEB组QEC组QED组F细胞自噬（IOD）0.331±0.0510.532±0.083a 0.713±0.092ab 0.932±0.112abc 1.121±0.072abcd 83.652**

Fig.1 Comparison of autophagy in gastric cancer cells(MDC staining,×200)图1 胃癌细胞自噬比较（MDC染色，×200）

Fig.2 Effects of different concentrations of quercetin on cell apoptosis rate图2 不同浓度QE对细胞凋亡率的影响

Tab.4 mRNA relative expression levels of p53,AMPK and mTOR in each group表4 各组p53、AMPK及mTOR的mRNA相对表达水平（n=6，±s）

Tab.4 mRNA relative expression levels of p53,AMPK and mTOR in each group表4 各组p53、AMPK及mTOR的mRNA相对表达水平（n=6，±s）

组别溶剂组QEA组QEB组QEC组QED组F p53 1.741±0.1422.372±0.271a 2.881±0.253ab 3.232±0.173abc 3.582±0.224abcd 68.161**AMPK 0.674±0.0721.063±0.113a 1.694±0.232ab 2.324±0.213abc 3.043±0.292abcd 138.052**mTOR 1.933±0.1231.273±0.092a 0.692±0.114ab 0.443±0.062abc 0.344±0.052abcd 328.332**

Tab.5 Comparison of protein expression of LC3Ⅱ/LC3Ⅰand p53/AMPK/mTOR signaling pathway between the five groups表5 各组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和p53/AMPK/mTOR信号通路蛋白表达的比较 （n=6，±s）

Tab.5 Comparison of protein expression of LC3Ⅱ/LC3Ⅰand p53/AMPK/mTOR signaling pathway between the five groups表5 各组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和p53/AMPK/mTOR信号通路蛋白表达的比较 （n=6，±s）

组别溶剂组QEA组QEB组QEC组QED组F LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ0.361±0.0411.872±0.131a 2.123±0.212ab 2.382±0.174abc 2.581±0.314abcd 728.532**P530.921±0.0421.312±0.061a 1.571±0.081ab 1.682±0.152abc 1.813±0.143abcd 69.124**AMPK 0.323±0.0330.532±0.043a 0.893±0.122ab 1.222±0.091abc 1.561±0.131abcd 183.954**mTOR 0.943±0.0630.693±0.041a 0.372±0.113ab 0.241±0.021abc 0.181±0.024abcd 165.932**

Fig.3 Comparison of LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ,p53∕AMPK∕mTOR signaling pathway proteins图3 LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ、p53∕AMPK∕mTOR信号通路蛋白比较

3 讨论

胃癌细胞的增殖、浸润和转移是大多数胃癌患者的主要死亡原因。有关QE对胃癌的抗肿瘤作用研究主要集中在对胃癌细胞生长、增殖及凋亡的影响及其可能作用机制［5］，但目前关于其对肿瘤细胞自噬的研究较少。细胞的增殖、自噬和凋亡是非常重要的生理过程，正常情况下细胞的增殖会受到自身限制，自噬程度较低，细胞凋亡现象正常，三者共同调控细胞生理过程。然而，在肿瘤细胞中这些平衡会被打破，肿瘤细胞增殖速度异常增加，凋亡水平下降。

P53蛋白能够活化DNA修复蛋白，从而抑制肿瘤的发生［6］。研究显示，活化的DNA修复蛋白能接合于DNA，启动Bax、P21等多个基因表达，使p21蛋白与细胞周期蛋白依赖激酶（CDK2）形成复合体，从而促进肿瘤细胞凋亡［7］。P53也可以调节细胞自噬的发生。有研究发现，AMPK信号通路与mTOR通路存在交叉，mTOR含有2种复合体mTORC1和mTORC2；P53可以激活AMPK，活化的AMPK会使mTORC1的表达下调，同时会活化UNC-51样激酶1（ULK1），诱导肿瘤细胞自噬［8］。自噬主要功能是降解过大的细胞结构，并通过重复利用氨基酸来维持细胞功能，使细胞在饥饿条件下存活［9］。自噬开始后，ULK1磷酸化并激活磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）复合物，在新生的自噬体膜上形成含有自噬相关蛋白（ATG）9的吞噬膜。在ATG4、ATG7和ATG3的活化作用下，LC3Ⅰ转化为LC3Ⅱ，LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ比值的大小可估计自噬水平的高低［10］。本研究结果显示，随着QE浓度的增加和作用时间的延长，肿瘤细胞的抑制率均明显增加；胃癌细胞自噬程度和凋亡率亦随QE浓度增加而增加，表明QE浓度越高，细胞自噬和凋亡也越明显。既往研究认为，QE具有抗氧化作用，可影响体内金属离子（Zn2+、Fe2+等）平衡，调节代谢状态，并已在直肠癌、肺癌等肿瘤细胞中得到证实［11-12］。研究发现，QE可调控Wnt∕β-catenin、P38 AMPK等多个信号通路［13-14］。李蔚等［14］研究发现，QE可以通过Wnt∕β-catenin信号通路促进伊马替尼（IM）敏感细胞K562和耐药细胞K562R的凋亡。王象鹏等［15］研究发现，QE可以通过调控P38∕AMPK信号通路，降低骨关节细胞中炎性因子的表达。文兰香等［16］研究发现，QE可以通过AMPK∕mTOR通路影响细胞自噬。Siaw等［17］研究发现，QE可以活化mTOR，促进L1929纤维细胞的增殖。本研究结果显示，随着QE浓度增加，胃癌细胞中p53、AMPK mRNA和蛋白相对表达水平均呈浓度依赖性增加，而mTOR mRNA和蛋白相对表达水平呈浓度依赖性降低，表明QE可通过p53∕AMPK∕mTOR信号通路抑制细胞增殖，增强胃癌细胞自噬水平，诱导肿瘤细胞凋亡。另有动物实验研究亦显示，QE能够诱导胃癌细胞凋亡，抑制胃癌细胞的增殖，证实QE可通过抑制PI3K∕Akt通路诱导线粒体凋亡［18-19］。

综上所述，QE可通过激活p53∕AMPK∕mTOR信号通路，增强肿瘤细胞自噬水平，促进胃癌细胞凋亡。